1. Método de detección de la actividad de la enzima naringinasa

Respuesta rápida: Las enzimas y los ingredientes de procesamiento de alimentos generalmente se seleccionan según el ajuste del sustrato, el rango de pH y temperatura, la dosis y si la especificación de uso final es aceptable para el proceso objetivo. La opción comercial más sólida es aquella que funciona de manera consistente en condiciones de procesamiento reales.

1-1 Método espectrofotómetro

El método espectrofotométrico de paranitrofenol utiliza p-nitrofenol-α-ramnósido ( pNP- α- Rha ) y p-nitrofenol-β-D-glucopiranósido ( pNP- β-Glu) como sustrato, para detectar la actividad enzimática de la α-ramnosidasa y la β-glucosidasa. Li Ping utilizó el método del espectrofotómetro de p-nitrofenol en el experimento de agregar β-glucosidasa de Aspergillus niger a la solución de p-nitrofenol-β-glucósido (pNPG) para la hidrólisis enzimática, y el valor de absorbancia se midió a una longitud de onda ultravioleta de 400 nm. Y a partir del valor de la absorbancia, calculan la actividad enzimática de la β-glucosidasa. Este método tiene una fuerte especificidad de sustrato, pero el sustrato estándar es costoso y no se puede determinar la actividad enzimática de la naringinasa para hidrolizar los glucósidos en los alimentos, por lo que este método no es adecuado para la detección de la actividad enzimática en la preparación industrial de naringinasa a gran escala.

El principio del método del espectrofotómetro Davis es que la naringina puede producir una reacción cromogénica con dietilenglicol al 90% en condiciones ligeramente alcalinas, y la producción de chalcona de naringina amarilla se puede detectar bajo luz ultravioleta con una longitud de onda de 420 nm. Según el valor de absorbancia medido, se puede calcular la cantidad restante del sustrato naringina y luego se puede obtener mediante cálculo la actividad de la naringinasa. Wang Weina et al. utilizó un método de Davis mejorado, tomó naringina como sustrato y agregó naringinasa producida por fermentación líquida de Aspergillus niger FFCC 848 para hidrólisis enzimática. La absorbancia se midió bajo luz ultravioleta de 420 nm y luego se calculó la actividad enzimática. El método del espectrofotómetro Davis para medir la actividad enzimática es simple de operar y tiene una velocidad rápida, por lo que este método se usa ampliamente en la detección en tiempo real de la producción de naringinasa mediante fermentación y la actividad de la naringinasa inmovilizada.

1-2 Cromatografía líquida de alta resolución

El principio de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es que la HPLC puede determinar con precisión y analizar cuantitativamente el sustrato naringina, el producto intermedio purunina y el producto final naringenina durante todo el proceso de hidrólisis, y luego calcular la actividad enzimática. Chen Yuelong y otros utilizaron HPLC para determinar el tiempo de retención de naringina, arbutina, miricetina y sus productos, lograron una separación completa con una resolución superior a 1,5 y monitorearon eficazmente el efecto de la naringinasa en múltiples glucósidos en el proceso de hidrólisis; al mismo tiempo, la actividad enzimática se determinó con precisión. El método HPLC tiene las ventajas de una alta precisión y puede evitar la interferencia de impurezas, pero en comparación con el método Davis, este método tiene un tiempo de detección más largo y un funcionamiento más complicado.

1-3 Método de determinación mejorado de la actividad de la enzima naringinasa

Usando el método Davis mejorado: se agregaron 0,8 ml de 0,8 g de solución de naringina L^-1 preparada con tampón de pH 4,5 al sistema de reacción que contenía 40 mg de naringinasa inmovilizada (o 0,2 ml de naringinasa libre). Colóquelo en un baño de agua a temperatura constante de 50 ℃ durante 30 min. Tome 0,1 ml de la solución de hidrólisis enzimática de reacción y agregue 5 ml de dietilenglicol (fracción en volumen del 90 %) y 0,1 ml de solución de NaOH (4 mol·L^-1) en tubos, y déjelo reposar durante 10 minutos después de mezclarlos uniformemente. Mida la absorbancia de la solución mixta a 420 nm.

La definición de la actividad de la enzima naringinasa (U): en una condición de pH 4,5, 50 ℃, 1 unidad de actividad enzimática es la cantidad de enzima necesaria para degradar 1 μg de naringina por minuto. La relación de actividad enzimática (U·g^-1 o U·mL^-1) se define como: en la condición de pH 4,5, 50 ℃, la actividad enzimática exhibida por 1 g de naringinasa inmovilizada (o 1 ml de naringinasa libre). La actividad enzimática relativa se calcula según la siguiente fórmula:

Actividad enzimática relativa /% = actividad enzimática/actividad enzimática máxima×100

Determinación de la curva estándar: las concentraciones de masa de la solución estándar de glucósido naringina se ordenan 0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 g · L^-1, y luego se tomaron 0,1 mL de solución para la reacción con 5 mL de dietilenglicol (90%, v/v) y 0,1 mL solución de hidróxido de sodio (4 mol·L^-1). Después de que la mezcla se mezcló uniformemente y se mantuvo durante 10 minutos, se midió el valor de absorción de luz de la solución mezclada a 420 nm y se dibujó la curva estándar en consecuencia.

2. Preparación de solución de enzima naringinasa

El Aspergillus niger FFCC uv-11 almacenado a 4 ℃ se transfirió al medio inclinado y las esporas maduras se obtuvieron mediante cultivo a temperatura constante a 30 ℃ durante 96 h. Luego, las esporas se lavaron con solución salina normal estéril con una fracción de masa del 0,9 %. el valor de absorbancia de la suspensión de esporas se mide a 600 nm (valor DO600), con solución salina estéril su valor DO600 se ajustó a 0,200. Y luego la suspensión de esporas con la fracción en volumen del 10% de inoculación asciende a 100 ml de medio de fermentación (matraz cónico de 250 ml). El caldo de fermentación obtenido se centrifugó a 4 ℃ y 6000 r·min ^-1 durante 10 min en una centrífuga refrigerada. Luego, a través del filtro de succión para obtener el líquido sobrenadante, se requiere la enzima naringina y el líquido enzimático. Enfríelo a 4 ℃ para su uso posterior.

3. Preparación de enzima naringinasa inmovilizada con quitosano

Tome 3,0 g de quitosano, con 100 ml de fracción en volumen de solución de ácido acético al 2% se disolvió para preparar 0,3 g de solución coloidal de quitosano L^-1, se sonicó durante 20 minutos para eliminar las burbujas de aire y se dejó que se disolviera por completo. La solución coloidal de quitosano se inyectó gota a gota con una aguja en 0,5 g de condensado de NaOH L^-1 (1000 ml) para formar gránulos suaves. Se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 h y los gránulos se lavaron repetidamente con agua destilada hasta neutralidad y el agua se absorbió con un papel de filtro para obtener las microesferas de quitosano. Se pesaron 0,4 g de microesferas de quitosano, se agregaron 0,4 ml de glutaraldehído con una fracción de volumen del 6% y las microesferas se lavaron repetidamente con agua destilada hasta que no quedó glutaraldehído en la superficie de las microesferas después de temperatura constante y vibración a 25 ℃ 150 r·min^-1 durante 2 h. Las microesferas de quitosano reticuladas se obtuvieron secando con papel de filtro.

 Dijo 0,4 g de microesferas de quitosano, agregar 0,4 mL miembro número de créditos 6% de glutaraldehído, a 150 r · min^-1 a 25 ℃ de oscilación de temperatura Después de 2 h, se lavó repetidamente con agua destilada microesfera hasta que la superficie de la misma no sea pentilo. Se secan dialdehído y papel de filtro para obtener microesferas de quitosano reticuladas. Tome 4 ml de solución de enzima naringinasa, agréguelo a 0,4 g de microesferas de quitosano reticuladas, agite a una temperatura constante de 25 ℃, 150 r·min^-1 durante 2 h y colóquelo en un refrigerador a 4 ℃ para el acoplamiento de adsorción durante 4 h. Enjuague la solución de enzima residual en la superficie del soporte con tampón de pH 4,5, absorba el agua en el papel de filtro para obtener naringinasa inmovilizada y guárdela en un refrigerador a 4 ℃ para su uso posterior.

4. Preparación de microesferas magnéticas de quitosano (MSC) a base de silicio

El proceso de preparación de nanopartículas magnéticas basadas en silicio (MS) se muestra en la Figura 1.

Figura 1 Diagrama esquemático de preparación de nanopartículas magnéticas basadas en silicio

( 1) Primero, se prepararon nanopartículas magnéticas de Fe₃O₄ modificadas con ácido cítrico mediante el método de coprecipitación química, y el procedimiento experimental que comprende: 2,25 g de FeCl₃·6H₂O y 1.Se añaden 61 g de FeSO₄ · 7H₂O en un matraz de tres bocas lleno con 100 ml de agua desionizada, la temperatura del sistema se calentó a 85 ℃ en condiciones de gas nitrógeno. Agite a 1000 r·min^-1 y vierta rápidamente 10 ml de agua con amoníaco concentrado. Después de que la solución se vuelva negra, agregue 153 mg de citrato de sodio. Después de 30 minutos de reacción, separar la producción con un imán y lavar la fase sólida con agua desionizada y etanol varias veces. Las nanopartículas Fe₃O₄ obtenidas se secan para su posterior uso.

( 2) Luego, se prepararon nanopartículas magnéticas a base de silicio (MS) mediante el método sol-gel, que se muestra en la Figura 1. Los pasos experimentales incluyen: 0,1 g de Fe₃O₄ las nanopartículas se dispersaron uniformemente en una solución mixta que contenía 40 ml de anhidro etanol, 10 mL de agua destilada y 1,2 mL de agua con amoníaco concentrado. En condiciones de agitación de 300 r·min ^-1, se agregaron gotas de solución que contenían nanopartículas de Fe₃O₄ a TEOS (0,4 ml) dispersadas en 30 ml de etanol anhidro, y se realizó la reacción a base de silicio. Las nanopartículas se llevaron a cabo durante 12 h a temperatura ambiente. Los productos se lavaron con etanol anhidro y agua destilada varias veces para obtener nanopartículas magnéticas a base de sílice (MS), que se secaron para su uso posterior.

Las microesferas

MSC se prepararon mediante el método de reticulación en emulsión, como se muestra en la Figura 2. Los pasos experimentales incluyeron: 0,125 g de nanopartículas de sílice magnética (MS) dispersadas uniformemente en 10 ml de solución de quitosano con una fracción de masa del 2,5 % preparada con quitosano disuelto en una solución de ácido acético con una fracción de volumen del 5,0 %, y luego agregar la solución de quitosano a una emulsión que contiene 60 ml de cera de parafina líquida y 1,8 ml dos 80 gota a gota. Después de agitar durante 30 minutos en condiciones de baño de agua a 40 ℃ y 800 r·min ^-1, agregue 2,0 ml de glutaraldehído y reaccione durante 1 h. Luego, el pH del sistema se ajustó a 9,0 con 1 mol·L^-1 NaOH y la reacción continuó durante 1 h. Los productos se lavaron con éter de petróleo, etanol y agua destilada varias veces para obtener microesferas de MSC, las cuales se secaron al vacío para su posterior uso.

Figura 2 Diagrama esquemático de preparación de microesferas de quitosano magnéticas a base de silicio

5. Preparación de microesferas de quitosano magnéticas a base de silicio a base de epoxi (MSCE)

Se pesaron 0,5 g de microesferas de MSC secas preparadas mediante el método de 4 y se añadieron a un matraz cónico de 50 ml. Luego se agregaron al matraz 2,0 ml de solución de NaOH, solución de epicrolohidrina y solución de NaBH₄ con una cierta concentración, respectivamente. Y la reacción se llevó a cabo mediante oscilación constante de temperatura durante un tiempo determinado. El mecanismo de reacción de preparación de MSCE se muestra en la Figura 3.

Figura 3 El principio de preparación de microesferas de quitosano magnéticas a base de silicio a base de epoxi

Después de la activación, las microesferas activadas se lavan repetidamente con agua destilada hasta que no queden grupos OH libres ni epoxi en la superficie para obtener microesferas de quitosano magnéticas a base de silicio epoxi (MSCE). El método de detección es el siguiente: tomar 3,0 ml del sobrenadante de lavado y añadir 1 a 2 gotas de fenolftaleína. Después de agitar, si no se puso rojo, significa que no hay OH- libre con MSCE; tome 3,0 ml del sobrenadante de lavado y agregue 3,0 ml de 1,3 mol·L^-1 tiosulfato de sodio y 1 ~2 gotas de fenolftaleína, si la solución no se puso roja después de agitar, significa que no tiene grupos epoxi libres con MSCE. La ecuación de reacción para la detección del grupo epoxi es la siguiente:

6 Preparación de enzima naringinasa inmovilizada MSCE

Se agregaron 5,0 g de MSCE preparado mediante el método 5 a 50 ml de solución de enzima naringinasa con un cierto pH, y la reacción se osciló en un baño de agua a temperatura constante, como se muestra en la Figura 4. Después de la reacción, las microesferas se lavaron con solución tampón varias veces hasta que no se encontró naringinasa libre en la superficie de las microesferas.Las microesferas se drenaron mediante un embudo Brinella para obtener la enzima naringinasa inmovilizada con MSCE, que se refrigeró a 4 ℃ para su uso posterior. 

Figura 4 El principio de preparación de la enzima naringinasa inmovilizada MSCE

A lista de verificación práctica de abastecimiento para temas de enzimas, biotecnología e ingredientes alimentarios

En proyectos de procesamiento de alimentos y enzimas, el marco de decisión más útil suele ser el ajuste de la aplicación más la estabilidad del proceso: qué ingrediente funciona bajo las condiciones de pH, temperatura, tiempo y sustrato previstas sin crear un problema de cumplimiento o calidad posterior.

• Defina primero el objetivo de procesamiento: Las aplicaciones de sabor, hidrólisis, textura, fermentación, limpieza y bioprocesos a menudo necesitan perfiles de actividad muy diferentes.
• Compruebe la ventana operativa real: El pH, la temperatura, el tiempo de residencia y el tipo de sustrato a menudo importan más que la afirmación principal del producto.
• Revisar la consistencia y el impacto posterior:La dosis, la influencia sensorial, la filtración y el comportamiento de vida útil de pueden afectar el valor comercial final.
• Utilice validación piloto:Las pruebas de producción pequeñas de generalmente revelan las diferencias más útiles en actividad, eficiencia y ajuste del proceso.

Referencias de productos recomendados

• CHLUMICRYL HEMA: Una conocida referencia de monómero polar en sistemas basados en adhesión y reactividad.
• Longzyme Lipasa: Una referencia directa del producto para discusiones sobre alimentos, limpieza o bioprocesos relacionados con la lipasa.
• Longzyme Beta-Amylase: Una referencia práctica de enzimas cuando se están revisando la conversión del almidón y la actividad de procesamiento de alimentos.
• Glucoamilasa compuesta de longzima: Una referencia enzimática útil cuando la sacarificación o el rendimiento del procesamiento relacionado son importantes.

Preguntas frecuentes para compradores y formuladores

¿Por qué una enzima de alta actividad no es automáticamente la mejor opción comercial?
Porque la mejor enzima es la que funciona de manera confiable en las condiciones reales del proceso y brinda el resultado final deseado sin crear nuevos problemas.

¿Deben seleccionarse los ingredientes alimentarios y biotecnológicos únicamente a partir de hojas de datos?
Por lo general, es más seguro combinar la revisión de especificaciones con una prueba piloto o de aplicación porque los sustratos reales y las ventanas de proceso pueden cambiar mucho el resultado.

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Glucoamilasa compuesta	9032-08-0
Pullulanasa	9075-68-7
Xilanasa	37278-89-0
Celulasa	9012-54-8
Naringinasa	9068-31-9
β-amilasa	9000-91-3
Glucosa oxidasa	9001-37-0
alfa-amilasa	9000-90-2
Pectinasa	9032-75-1
Peroxidasa	9003-99-0
Lipasa	9001-62-1
Catalase	9001-05-2
TANNASE	9025-71-2
Elastase	39445-21-1
Urease	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-Láctica deshidrogenasa	9001-60-9
Malato de deshidrogenasa	9001-64-3
Colesterol oxidasa	9028-76-6