1. Método de detección de la actividad enzimática de la naringinasa
1-1 Método espectrofotométrico
El método espectrofotométrico con para nitrofenol utiliza p-nitrofenol-α-ramnósido (pNP-α-Rha) y p-nitrofenol-β-D-glucopiranosido (pNP-β-Glu) como sustrato para detectar la actividad enzimática de la α-ramnosidasa y la β-glucosidasa. Li Ping utilizó el método espectrofotométrico con p-nitrofenol en un experimento en el que se añadió β-glucosidasa de Aspergillus niger a una solución de p-nitrofenol-β-glucósido (pNPG) para la hidrólisis enzimática, y se midió el valor de la absorbancia a una longitud de onda ultravioleta de 400 nm. A partir del valor de la absorbancia, se calcula la actividad enzimática de la β-glucosidasa. Este método tiene una fuerte especificidad de sustrato, pero el sustrato estándar es caro y no permite determinar la actividad enzimática de la naringinasa para hidrolizar glucósidos en alimentos, por lo que no es adecuado para la detección de la actividad enzimática en la preparación industrial a gran escala de naringinasa.
El principio del método del espectrofotómetro Davis es que la naringina puede producir una reacción cromogénica con dietilenglicol al 90 % en condiciones ligeramente alcalinas, y la producción de naringina chalcona amarilla puede detectarse bajo luz ultravioleta con una longitud de onda de 420 nm. Según el valor de absorbancia medido, se puede calcular la cantidad restante del sustrato naringina y, a continuación, se puede obtener la actividad de la naringinasa mediante cálculo. Wang Weina et al. utilizaron un método Davis mejorado, tomaron la naringina como sustrato y añadieron naringinasa producida por fermentación líquida de Aspergillus niger FFCC 848 para la hidrólisis enzimática. La absorbancia se midió bajo luz ultravioleta de 420 nm y, a continuación, se calculó la actividad enzimática. El método del espectrofotómetro Davis para medir la actividad enzimática es sencillo de manejar y rápido, por lo que se utiliza ampliamente en la detección en tiempo real de la producción de naringinasa por fermentación y de la actividad de la naringinasa inmovilizada.
1-2 Cromatografía líquida de alta resolución
El principio de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es que la HPLC puede determinar con precisión y analizar cuantitativamente el sustrato naringina, el producto intermedio purunina y el producto final naringenina durante todo el proceso de hidrólisis, y luego calcular la actividad enzimática. Chen Yuelong y otros utilizaron la HPLC para determinar el tiempo de retención de la naringina, la arbutina, la miricetina y sus productos, y lograron una separación completa con una resolución superior a 1,5, además de monitorizar eficazmente el efecto de la naringinasa sobre múltiples glucósidos en el proceso de hidrólisis y determinar con precisión la actividad enzimática. El método HPLC tiene la ventaja de ser muy preciso y evitar la interferencia de impurezas, pero, en comparación con el método Davis, tiene un tiempo de detección más largo y un funcionamiento más complicado.
1-3 Método mejorado para determinar la actividad enzimática de la naringinasa
Utilizando el método Davis mejorado: se añadieron 0,8 ml de solución de naringina 0,8 g·L-1 preparada con tampón pH 4,5 al sistema de reacción que contenía 40 mg de naringinasa inmovilizada (o 0,2 ml de naringinasa libre). Se colocó en un baño de agua a temperatura constante de 50 ℃ durante 30 min. Se tomaron 0,1 mL de la solución de hidrólisis enzimática de la reacción y se añadieron 5 mL de dietilenglicol (fracción volumétrica del 90 %) y 0,1 mL de solución de NaOH (4 mol·L-1) en tubos, y se dejaron reposar durante 10 min después de mezclarlos uniformemente. Se midió la absorbancia de la solución mezclada a 420 nm.
Definición de la actividad de la enzima naringinasa (U): en condiciones de pH 4,5 y 50 ℃, 1 unidad de actividad enzimática es la cantidad de enzima necesaria para degradar 1 μg de naringina por minuto. La relación de actividad enzimática (U·g-1 o U·mL-1) se define como: en condiciones de pH 4,5 y 50 ℃, la actividad enzimática mostrada por 1 g de naringinasa inmovilizada (o 1 mL de naringinasa libre). La actividad enzimática relativa se calcula según la siguiente fórmula:
Determinación de la curva estándar: se disponen las concentraciones de masa de la solución de naringina glucósido estándar en 0, 0,4, 0,8, 1,2 y 1,6 g · L-1, y a continuación se toma 0,1 mL de la solución para la reacción con 5 mL de dietilenglicol (90 %, v / v) y 0,1 mL de solución de hidróxido de sodio ( 4 mol·L-1). Después de mezclar bien la mezcla y dejarla reposar durante 10 minutos, se mide el valor de absorción de la luz de la solución mezclada a 420 nm y se traza la curva estándar correspondiente.
2. Preparación de la solución enzimática de naringinasa
El Aspergillus niger FFCC uv-11 almacenado a 4 ℃ se transfirió al medio inclinado y se obtuvieron las esporas maduras mediante cultivo a temperatura constante a 30 ℃ durante 96 h . A continuación, las esporas se lavaron con solución salina normal estéril con una fracción de masa del 0,9 %. El valor de absorbancia de la suspensión de esporas se midió a 600 nm (valor OD600) y, con solución salina estéril, su valor OD600 se ajustó a 0,200. A continuación, se añadió la suspensión de esporas con una fracción de volumen del 10 % de la cantidad de inoculación a 100 ml de medio de fermentación (matraz cónico de 250 ml). El caldo de fermentación obtenido se centrifugó a 4 ℃ y 6000 r·min-1 durante 10 min en una centrífuga refrigerada. A continuación, se pasó por un filtro de succión para obtener el líquido sobrenadante necesario para la enzima naringinasa. Se enfrió a 4 ℃ para su uso posterior.
3. Preparación de la enzima naringinasa inmovilizada en quitosano
Se tomaron 3,0 g de quitosano, se disolvieron en 100 ml de solución de ácido acético al 2 % para preparar una solución coloidal de quitosano de 0,3 g · L-1, se sonicó durante 20 minutos para eliminar las burbujas de aire y se dejó disolver completamente. La solución coloidal de quitosano se inyectó gota a gota con una aguja en 0,5 g · L-1 de condensado de NaOH (1000 ml) para formar gránulos lisos. Se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 h y los gránulos se lavaron repetidamente con agua destilada hasta que se neutralizaron, y el agua se absorbió con un papel de filtro para obtener las microesferas de quitosano. Se pesaron 0,4 g de microesferas de quitosano, se añadieron 0,4 ml de glutaraldehído con una fracción volumétrica del 6 % y las microesferas se lavaron repetidamente con agua destilada hasta que no quedara glutaraldehído en la superficie de las microesferas después de mantener una temperatura constante y una vibración de 25 ℃ y 150 r·min-1 durante 2 h. Las microesferas de quitosano reticuladas se obtuvieron mediante secado con papel de filtro.
Se tomaron 0,4 g de microesferas de quitosano, se añadieron 0,4 ml de glutaraldehído al 6 % en volumen, se sometieron a una temperatura de 25 °C y a una velocidad de 150 r·min-1 durante 2 h, se lavaron repetidamente con agua destilada hasta que no quedara glutaraldehído en la superficie de las microesferas y se secaron con papel de filtro para obtener microesferas de quitosano reticulado. Se tomaron 4 ml de solución enzimática de naringinasa, se añadieron a 0,4 g de microesferas de quitosano reticulado, se agitaron a una temperatura constante de 25 ℃, 150 r·min-1 durante 2 h, y se colocaron en un refrigerador a 4 ℃ para la adsorción. Se dejó en contacto durante 4 h. Enjuague la solución enzimática residual en la superficie del soporte con tampón de pH 4,5, absorba el agua en el papel de filtro para obtener naringinasa inmovilizada y guárdela en un refrigerador a 4 ℃ para su uso posterior.
4. Preparación de microesferas de quitosano magnético a base de silicio (MSC)
El proceso de preparación de nanopartículas magnéticas a base de silicio (MS) se muestra en la figura 1.
Figura 1. Diagrama esquemático de la preparación de nanopartículas magnéticas basadas en silicio
( 1) En primer lugar, se prepararon nanopartículas magnéticas de Fe3O4 modificadas con ácido cítrico mediante un método de coprecipitación química, y el procedimiento experimental que comprende: Se añaden 2,25 g de FeCl3·6H2O y 1,61 g de FeSO4·7H2O a un matraz de tres bocas lleno con 100 ml de agua desionizada, y se calienta el sistema a 85 ℃ en atmósfera de nitrógeno. Se agita a 1000 r·min-1 y se vierte rápidamente 10 ml de agua amoniacal concentrada. Una vez que la solución se vuelve negra, se añaden 153 mg de citrato de sodio. Tras 30 minutos de reacción, se separa el producto con un imán y se lava la fase sólida varias veces con agua desionizada y etanol. Las nanopartículas de Fe3O4 obtenidas se secan para su uso posterior.
( 2) A continuación, se prepararon nanopartículas magnéticas de silicio (MS) mediante el método sol-gel, como se muestra en la figura 1. Los pasos experimentales incluyen: se dispersaron uniformemente 0,1 g de nanopartículas de Fe3O4 en una solución mixta que contenía 40 ml de etanol anhidro, 10 ml de agua destilada y 1,2 ml de agua amoniacal concentrada. Bajo agitación a 300 r·min-1, se añadieron gotas de la solución que contenía nanopartículas de Fe3O4 a TEOS (0,4 ml) disperso en 30 ml de etanol anhidro, y se llevó a cabo la reacción de las nanopartículas a base de silicio durante 12 h a temperatura ambiente. Los productos se lavaron varias veces con etanol anhidro y agua destilada para obtener nanopartículas de sílice magnética (MS), que se secaron para su uso posterior.
Las microesferas MSC se prepararon mediante un método de reticulación por emulsión, como se muestra en la figura 2. Los pasos experimentales incluyeron: Se dispersaron uniformemente 0,125 g de nanopartículas de sílice magnética (MS) en 10 ml de solución de quitosana con una fracción molar del 2,5 %, preparada disolviendo quitosana en una solución de ácido acético con una fracción volumétrica del 5,0 %, y a continuación se añadió la solución de quitosana a una emulsión que contenía 60 ml de cera de parafina líquida y 1,8 ml de Twain 80 gota a gota. Tras agitar durante 30 minutos en un baño de agua a 40 ℃ y 800 r·min-1, se añadieron 2,0 ml de glutaraldehído y se dejó reaccionar durante 1 hora. A continuación, se ajustó el pH del sistema a 9,0 con NaOH 1 mol·L-1 y se continuó la reacción durante 1 hora. Los productos se lavaron varias veces con éter de petróleo, etanol y agua destilada para obtener microesferas de MSC, que se secaron al vacío para su uso posterior.
Figura 2. Diagrama esquemático de la preparación de microesferas de quitosana con base magnética de silicio
5. Preparación de microesferas de quitosana con base magnética de silicio y epoxi (MSCE)
Se pesaron 0,5 g de microesferas MSC secas preparadas mediante el método 4 y se añadieron a un matraz cónico de 50 ml. A continuación, se añadieron al matraz 2,0 ml de solución de NaOH, solución de epiclorhidrina y solución de NaBH4 con una concentración determinada, respectivamente. La reacción se llevó a cabo mediante oscilación a temperatura constante durante un tiempo determinado. El mecanismo de reacción de la preparación de MSCE se muestra en la figura 3.
Figura 3. Principio de preparación de microesferas magnéticas de quitosana con base de silicio y epoxi
Tras la activación, las microesferas activadas se lavan repetidamente con agua destilada hasta que no quedan grupos OH y epoxi libres en la superficie, con el fin de obtener microesferas magnéticas de quitosana con base de silicio y epoxi (MSCE). El método de detección es el siguiente: se toman 3,0 ml del sobrenadante del lavado y se añaden 1-2 gotas de fenolftaleína. Después de agitar, si no se vuelve rojo, significa que no hay OH libre con MSCE; se toman 3,0 ml del sobrenadante del lavado y se añaden 3,0 ml de tiosulfato de sodio 1,3 mol·L-1 y 1-2 gotas de fenolftaleína; si la solución no se vuelve roja después de agitar, significa que no hay grupos epoxi libres con MSCE. La ecuación de reacción de la detección del grupo epoxi es la siguiente:
6 Preparación de la enzima naringinasa inmovilizada en MSCE
Se añadieron 5,0 g de MSCE preparado según el método 5 a 50 ml de solución de enzima naringinasa con un pH determinado, y la reacción se agitó en un baño de agua a temperatura constante, como se muestra en la figura 4. Tras la reacción, las microesferas se lavaron con solución tampón varias veces hasta que no se encontró naringinasa libre en la superficie de las microesferas. Las microesferas se escurrieron con un embudo Brinella para obtener la enzima naringinasa inmovilizada en MSCE, que se refrigeró a 4 ℃ para su uso posterior.
Figura 4. Principio de preparación de la enzima naringinasa inmovilizada en MSCE.
¡Póngase en contacto con nosotros ahora!
Si necesita información sobre precios, rellene el formulario con sus datos de contacto y nos pondremos en contacto con usted en un plazo de 24 horas. También puede enviarme un correo electrónico a info@longchangchemical.com en horario laboral (de 8:30 a 18:00, UTC+8, de lunes a sábado) o utilizar el chat en vivo de la página web para obtener una respuesta inmediata.
