¿Cuál es el proceso de producción de bioenzimas?
Respuesta rápida: Las enzimas y los ingredientes de procesamiento de alimentos generalmente se seleccionan según el ajuste del sustrato, el rango de pH y temperatura, la dosis y si la especificación de uso final es aceptable para el proceso objetivo. La opción comercial más sólida es aquella que funciona consistentemente en condiciones de procesamiento reales.
1.Producción de enzimas
Las enzimas se producen a partir de microorganismos, animales y plantas, pero la fuente principal son los microorganismos. Dado que los microorganismos tienen más ventajas que las plantas y los animales, generalmente se seleccionan cepas productoras de enzimas excelentes para producir enzimas mediante fermentación. Para aumentar la concentración de enzimas en el caldo de fermentación, se seleccionan cepas excelentes, se desarrollan bacterias genéticamente modificadas y se optimizan las condiciones de fermentación. La producción industrial necesita un rendimiento especial de nuevas enzimas, como la α-amilasa resistente a altas temperaturas, la proteasa y lipasa resistentes a los álcalis, etc. Por lo tanto, necesitamos investigar y desarrollar cepas para producir un rendimiento especial de nuevas enzimas.
2.Preparación enzimática
La tecnología de separación y purificación de enzimas es el núcleo del actual «proceso de postratamiento» biotecnológico. El uso de una variedad de técnicas de separación y purificación, desde células microbianas y su caldo de fermentación, o células animales y vegetales y su caldo de cultivo en la separación y purificación de enzimas, hechas de preparaciones enzimáticas altamente activas de diferente pureza, para hacer que las preparaciones enzimáticas se utilicen más ampliamente en todos los aspectos de la economía nacional, debe mejorar la actividad de las preparaciones enzimáticas, su pureza y rendimiento, siendo necesario estudiar las nuevas técnicas de separación y purificación.
3.Inmovilización enzimática y celular
La investigación de enzimas y de inmovilización celular es la tarea central de la ingeniería enzimática. Para mejorar la estabilidad de las enzimas, reutilizar las preparaciones de enzimas, ampliar el rango de aplicación de las preparaciones de enzimas, utilizando una variedad de métodos de inmovilización para la inmovilización de enzimas, la preparación de enzimas inmovilizadas, como la glucosa isomerasa inmovilizada, la carbamoilasa inmovilizada, etc., la determinación de enzimas inmovilizadas y las enzimas inmovilizadas para la aplicación de diversos aspectos del desarrollo de la investigación. La enzima inmovilizada todavía tiene una gran vitalidad. Es muy valorado por diversos campos como la bioquímica, la ingeniería química, la microbiología, los polímeros y la medicina.
Las células inmovilizadas se desarrollan sobre la base de enzimas inmovilizadas.Se utilizan varios métodos de inmovilización para inmovilizar células microbianas, células animales y células vegetales para producir una variedad de células biológicas inmovilizadas. El estudio de las propiedades enzimáticas de las células inmovilizadas, especialmente las propiedades cinéticas, y la investigación y el desarrollo de células inmovilizadas en diversas aplicaciones es un tema candente en la ingeniería enzimática hoy en día.
La tecnología de inmovilización es un hito importante en la modernización de la tecnología enzimática y es una tecnología innovadora para superar las deficiencias de las enzimas naturales en aplicaciones industriales y aprovechar al máximo las características de la reacción enzimática. Se puede decir que no existe tecnología enzimática moderna sin el desarrollo de la tecnología de inmovilización.
4. Modificación molecular enzimática
También conocida como modificación molecular enzimática. Para mejorar la estabilidad de la enzima, reducir la antigenicidad, extender la vida media de las bacterias medicinales en el cuerpo, utilizar varios métodos de modificación para modificar la estructura de la molécula de la enzima, para crear una enzima natural que no tenga algunas características excelentes (como mayor estabilidad, ausencia de antigenicidad, resistencia a la hidrólisis de proteasa, etc.), e incluso crear una nueva actividad enzimática, expandir la aplicación de la enzima, aumentar el valor de la aplicación de la enzima y lograr mayores beneficios económicos y sociales. y beneficios sociales.
La modificación molecular de la enzima se puede realizar desde dos aspectos:
(1) Utilizar tecnología de ingeniería de proteínas para modificar el gen de la estructura de la molécula de enzima, esperando obtener la nueva enzima (enzima mutante) con excelentes características y alta actividad que tenga una estructura primaria y una estructura espacial razonables.
(2) Modificación química o enzimática de la estructura primaria de proteínas enzimáticas, o modificación química de la molécula de enzima con modificación química del grupo de cadena lateral. Para cambiar las propiedades enzimáticas. Estas enzimas son particularmente útiles en la investigación básica en enzimología y medicina.
Los microorganismos utilizados en la producción de enzimas son hongos filamentosos, levaduras y bacterias en tres grandes grupos, principalmente con bacterias aeróbicas. A continuación se enumeran las cepas y usos de varias de las principales enzimas industriales:
Amilasa
Las amilasas hidrolizan el almidón para producir oligosacáridos de malta pastosos y maltosa. En la producción predomina la fermentación profunda con Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis del género Bacillus, el último de los cuales produce enzimas resistentes al calor. También se utilizan fermentaciones profundas y semisólidas con cepas de Aspergillus y Rhizopus para el procesamiento de alimentos [6].Las amilasas se utilizan principalmente en la producción de azúcar, el desencolado de textiles, el tratamiento de materias primas de fermentación y el procesamiento de alimentos. La glucoamilasa puede hidrolizar el almidón en glucosa, que ahora se produce casi en su totalidad mediante una fermentación profunda de Aspergillus niger y se utiliza en la producción de azúcar, la producción de alcohol y el procesamiento de materias primas de fermentación.
Proteasa
El uso de cepas y producción de la mayor cantidad de variedades. Con bacilo en forma de liquen, bacilo pequeño y corto y bacilo subtilis para la producción de fermentación profunda de proteasa bacteriana; con streptomyces, producción de fermentación profunda de Aspergillus de proteasa neutra y proteasa ácida de Aspergillus, utilizada para el depilado del cuero, el suavizado de pieles, productos farmacéuticos y la industria alimentaria; con Trichoderma spp. algunas de las bacterias en la fermentación semisólida producen cuajo en la fabricación de queso en lugar del cuajo extraído del estómago del ternero original.
Glucosa isomerasa
Una especie se desarrolló rápidamente en los años 70. Las células de Streptomyces se obtienen primero mediante fermentación profunda y, después de la inmovilización, la solución de glucosa se convierte en un jarabe que contiene aproximadamente un 50% de fructosa, que puede usarse en la industria alimentaria en lugar de sacarosa. Con amilasa, glucoamilasa y glucosa isomerasa, etc., el almidón de maíz se convertirá en almíbar y se ha convertido en una de las industrias azucareras emergentes.
Selección de sistemas de expresión
1 sistema de expresión de E. coli
①Se prefiere el sistema de expresión pET
② La expresión y purificación de proteínas recombinantes se puede realizar utilizando etiquetas solubilizadas; se prefiere MBP como primera opción.
③ Se prefiere pET24 o pET28 (si se necesita purificación) con BL21(DE3), medio TB con crecimiento de 37° hasta 1-1,5 OD, crecimiento a 18 ℃ durante 1 hora hasta 3 OD, inducción de IPTG 0,5 mM durante 19 horas hasta OD hasta 10.
④ Medidas de rescate para alta expresión y baja solubilidad: enfriar hasta 15 ℃; cambiar el medio a 2xYT o ZYP5052 (autoinducido), cambiar el huésped de expresión; truncamiento de los residuos de aminoácidos 2-10 N-terminal y/o C-terminal; expresión por fusión con proteínas altamente solubles, como MBP; inducir químicamente chaperonas moleculares, coexpresar chaperonas moleculares/proteínas que interactúan o proporcionar ligandos.
⑤ Ventajas y desventajas del sistema de expresión de E. coli
Ventajas: más conveniente, más efectivo
Desventajas: capacidad débil de expresión de secreciones; dificultad en la formación de enlaces disulfuro; sin modificación postraduccional
2 Sistema de expresión de levadura (Picrosporum)
Ventajas: integración estable de genes exógenos; el promotor del gen de la alcohol oxidasa es fuerte y la expresión puede regularse estrictamente con metanol; las proteínas recombinantes pueden expresarse en formas intracelulares o extracelulares;contiene funciones de modificación postraduccional comunes a los sistemas de expresión eucariotas; hay hosts/vectores comerciales, que son fáciles de operar; Fácil de amplificar y la densidad de fermentación es extremadamente alta.
② Desventajas: forma única de procesamiento postraduccional; Problema de glicosilación excesiva.
3 La primera opción es el sistema de expresión reportado en la literatura, la segunda opción es el sistema de E. coli y el sistema de levadura se usa si la expresión en E. coli está inactiva. Según la fuente del gen para determinar el sistema de expresión, el gen más etiquetas de afinidad para facilitar la purificación.
Modificación enzimática
①Diseño racional: basado en la información de estructura y función de la proteína en la prueba de expresión de recombinación y cambio de genes codificantes.
Procedimiento: en primer lugar, obtener la estructura enzimática de la base de datos BRENDA, luego modificar la estructura enzimática y predecir la estructura enzimática con Alphafold2, luego realizar un análisis de acoplamiento entre la enzima y la molécula de ligando con el software PyMOL y, finalmente, de acuerdo con la nueva estructura enzimática, mutar las secuencias genéticas direccionalmente y luego expresarlas de forma recombinante para obtener una nueva enzima (para mejorar la estabilidad térmica, la eficiencia catalítica y la especificidad del sustrato de la enzima).
② Diseño irracional: mutación de alta frecuencia o recombinación de secuencias codificantes y expresión recombinante y pruebas de alto rendimiento
Proceso de diseño ab initio: 1. algoritmo de muestreo y desarrollo del campo de fuerza 2. pruebas de alto rendimiento 3. identificación de la estructura
Evolución dirigida de proteínas.
①Seleccione genes originales
②Establecer una biblioteca de mutaciones genéticas de diversidad
③ Vincular múltiples genes mutados en vectores y expresarlos en las cepas correspondientes respectivamente
④ Seleccione un gen mutante de alta calidad mediante detección y luego exprese el gen mutante en grandes cantidades.
Métodos para generar bibliotecas de genes mutantes.
①Mutación aleatoria de alta frecuencia in vivo: utilice E. coli XL1-Red como huésped de replicación genética (sistema de reparación de daños en el ADN defectuoso)
Cultivado hasta la etapa de meseta, se produce una mutación de 1 base en 2 Kb en promedio.
②Kit de mutagénesis aleatoria: tasa de mutación 0,1 -1,6 %/PCR, equivalente a mutaciones de 1 a 16 bases/gen
③ Mutagénesis de saturación punto por punto
Evolución natural: mutación espontánea, recombinación, selección natural
Evolución agrícola: mutación espontánea, reproducción, cribado.
Evolución de laboratorio: tasa de mutación acelerada, mejoramiento molecular, detección.
Mezcla de ADN
Estrategia experimental de ingeniería de proteínas.
①Seleccione el gen inicial para establecer un sistema de inactivación y/o un método de detección.
②Si se conoce la relación estructura-función, primero adopte un método de diseño racional.
③Ajuste de mutación aleatoria y detección de alto rendimiento④Diseñe desde cero solo si no existe un gen inicial adecuado.
Técnicas de investigación de proteínas
1 Propiedades físicas y químicas relacionadas con la separación y purificación de proteínas.
Tamaño molecular (diálisis, ultrafiltración, filtración en gel, centrifugación)
②Forma molecular (centrifugación en gradiente, electroforesis)
(iii) Propiedades cargadas (electroforesis, cromatografía de intercambio iónico)
(iv) Propiedades de solubilización (salinización, precipitación con disolventes orgánicos)
⑤ Diferencias en la unión específica a ligandos (cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de bioafinidad, cromatografía de afinidad de quelatos metálicos)
(vi) Propiedades de adsorción (cromatografía hidrofóbica)
(vii) desnaturalización y desnaturalización (desnaturalización y desnaturalización de la urea)
2 Sistema de expresión de proteínas
① Sistema de expresión bacteriana: ciclo corto, alta eficiencia, bajo costo, pero sin modificación postraduccional. Se utiliza principalmente para la producción de proteínas procarióticas, proteínas eucariotas simples.
Selección de vector de expresión: serie pet, serie pGEX, PQE30……
Selección de cepas de expresión: BL21(DE3), Rosetta, M15……
Condiciones de inducción: concentración de IPTG, temperatura y duración del tiempo.
Purificación: Ni-NTA (Su etiqueta), Strep-beads, GST…..
② Sistema de expresión de levadura: ciclo corto, alta eficiencia, bajo costo, existe modificación postraduccional. Habrá glicosilación inapropiada y modificación elevada de manosa. Se utiliza principalmente para producir proteínas intracelulares/secretoras, proteínas de unión a disulfuro y proteínas glicosiladas.
(iii) Sistema de expresión de bacteriófagos: alta capacidad genética, proteína soluble, adecuado para la producción de proteínas tóxicas, modificaciones postraduccionales similares a las de los mamíferos. Las condiciones de cultivo son duras y carece de algunas modificaciones de glicosilación. Utilizado principalmente para la producción de proteínas de membrana, proteínas de gran tamaño, vacunas virales, proteínas de señalización, citoquinas, quinasas.
El genoma del baculovirus tiene una enorme capacidad para inserciones de genes exógenos de hasta 38 kb.
Los baculovirus se producen en células de insectos y no se replican en células de mamíferos.
Ventajas: los baculovirus se pueden transducir eficazmente en líneas celulares de mamíferos, incluidas células primarias y madre.
Seguridad (no se replica en células de mamíferos) y falta de efectos citopáticos observables
Las células pretransducidas almacenadas congeladas también se pueden utilizar como células de preparación de pruebas.
Portabilidad (para análisis de tipos de células farmacológicamente relevantes)
Velocidad de desarrollo de pruebas (no es necesario perder tiempo generando líneas celulares estables)
④ Sistemas de expresión en mamíferos: tiempo de ciclo largo, baja eficiencia, presencia de modificaciones postraduccionales, alta bioactividad proteica. Se utiliza principalmente para producir proteínas eucariotas complejas, proteínas que requieren PTM precisa.Expresión transitoria de proteínas: PEI o reactivos de transfección de liposomas.
Desarrollo de líneas celulares estables: plataformas de ingeniería celular Flp-In™ Jump-In™
Expresión inducible: expresión regulada por tetraciclina
Expresión mediada por entrega viral: sistema de expresión lentiviral para análisis funcional; sistema de expresión adenoviral para la producción de proteínas
3 Purificación de proteínas
¿Por qué necesitamos purificar las proteínas?
Caracterizar la estructura y función de proteínas de interés.
(ii) Estudiar la regulación de proteínas y las interacciones entre proteínas.
③ generar anticuerpos
Métodos de purificación
Basado en propiedades físicas/químicas.
Tamaño de proteína: diálisis, ultrafiltración, cromatografía de filtración en gel.
Carga de proteínas: cromatografía de intercambio iónico.
Hidrofobicidad de proteínas: cromatografía de interacción hidrofóbica
Basado en propiedades biológicas: cromatografía de afinidad.
①Diálisis
Factores que influyen: tubo de diálisis MWCO; volumen del buffer; tiempo de diálisis; frecuencia de reemplazo del tampón de diálisis
Ultrafiltración
Filtración centrífuga, el tamaño de la proteína es más pequeño que el tamaño de los poros del tubo de filtro, se centrifuga hasta el fondo del tubo.
③ Cromatografía de filtración en gel
Separar proteínas de diferentes tamaños.
④Cromatografía de intercambio iónico
Columna de intercambio catiónico: el gel tiene carga negativa, la proteína tiene carga positiva
Columna de intercambio aniónico: el gel tiene carga positiva, la proteína tiene carga negativa
Medio
Soporte inerte: agarosa, dextrano
Grupos cargados: carboximetilo: cargado negativamente, dietilamino: cargado positivamente
Iones de equilibrio: grupos con carga negativa: H+ o Na+ grupos con carga positiva: OH- o Cl-
Elución gradual o en gradiente de proteínas aumentando la concentración de sal o cambiando el pH.
⑤ Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad es un método para separar biomoléculas de una mezcla basado en interacciones de unión macromoleculares altamente específicas entre una biomolécula y otra sustancia.
Los ejemplos incluyen: unión de antígeno a anticuerpos, unión de enzima a ligandos, unión de proteínas de fusión de glutatión y GST, unión de proteínas anti-biotina a moléculas de unión de biotina e iones metálicos que se unen a proteínas de fusión de polihistidina.
Cromatografía de quelatos metálicos inmovilizados (IMAC) utilizando iones metálicos (Ni 2+; Co 2+; Cu 2+) unidos a proteínas marcadas con poli-(His) 6.
Purificación de proteínas marcadas con estreptococos.
Las perlas pueden adsorber específicamente proteínas con la etiqueta estreptocócica y luego, con biotina, la proteína se puede eluir de las perlas. (El principio es similar al experimento desplegable de GST)
Cromatografía de afinidad proteína A/proteína G
La proteína A y la proteína G genéticamente modificadas pueden unirse específicamente a la región Fc de la IgG de mamíferos.Al unir la proteína A y la proteína G al material de la columna, la IgG y sus subclases y fragmentos pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad.
Proteína A: peso molecular de 42 kDa, codificada por el gen spa, con 5 dominios estructurales de unión a inmunoglobulinas isotípicos, cada uno de los cuales consta de 3 hélices alfa.
Proteína G: con un peso molecular de 65 kDa, codificada por el gen spg, se une a los segmentos Fc y Fab del anticuerpo, así como a la albúmina del suero. La proteína G modificada genéticamente elimina el sitio de unión de la albúmina y retiene sólo el dominio de unión Fc, que es más potente que la proteína A. La proteína A/proteína G es una proteína modificada genéticamente que se une a la albúmina.
Proteína A/proteína G: es una proteína de unión genéticamente modificada. Consta de 4 dominios de unión de inmunoglobulina de proteína A y 2 de proteína G, que tiene un rango de unión más amplio que la proteína A o la proteína G solas y combina sus ventajas en uno, que se puede aplicar a la purificación de IgG de casi todas las especies.
¿Cómo identificar la proteína purificada?
PÁGINA SDS; HPLC; espectrometría de masas; transferencia occidental; Ensayos de unión; Ensayos funcionales; Elucidación estructural.
4 microscopía electrónica
Microscopía crioelectrónica de partícula única (Análisis de partícula única, SPA)
Microscopía de tomografía crioelectrónica (crio-ET)
A Lista de verificación práctica de abastecimiento para temas de enzimas, biotecnología e ingredientes alimentarios
En proyectos de procesamiento de alimentos y enzimas, el marco de decisión más útil suele ser el ajuste de la aplicación más la estabilidad del proceso: qué ingrediente funciona bajo las condiciones de pH, temperatura, tiempo y sustrato previstas sin crear un problema de cumplimiento o calidad posterior.
- Defina primero el objetivo de procesamiento: Las aplicaciones de sabor, hidrólisis, textura, fermentación, limpieza y bioprocesos a menudo necesitan perfiles de actividad muy diferentes.
- Compruebe la ventana operativa real: El pH, la temperatura, el tiempo de residencia y el tipo de sustrato a menudo importan más que la afirmación principal del producto.
- Revisar la consistencia y el impacto posterior:La dosis, la influencia sensorial, la filtración y el comportamiento de vida útil de pueden afectar el valor comercial final.
- Use validación piloto: las pequeñas pruebas de producción generalmente revelan las diferencias más útiles en actividad, eficiencia y ajuste del proceso.
Referencias de productos recomendados
- Longzyme Lipasa: Una referencia directa del producto para debates sobre alimentos, limpieza o bioprocesos relacionados con la lipasa.
- Longzyme Beta-Amylase: Una referencia práctica de enzimas cuando se están revisando la conversión del almidón y la actividad de procesamiento de alimentos.
- Glucoamilasa compuesta de longzima: Una referencia enzimática útil cuando la sacarificación o el rendimiento del procesamiento relacionado son importantes.
- YExtracto de levadura: Una referencia práctica de ingredientes cuando se trata de aplicaciones de sabor, fermentación o soporte de nutrientes.
Preguntas frecuentes para compradores y formuladores
¿Por qué una enzima de alta actividad no es automáticamente la mejor opción comercial?
Porque la mejor enzima es la que funciona de manera confiable en las condiciones reales del proceso y brinda el resultado final deseado sin crear nuevos problemas.
¿Deben seleccionarse los ingredientes alimentarios y biotecnológicos únicamente a partir de hojas de datos?
Por lo general, es más seguro combinar la revisión de especificaciones con una prueba piloto o de aplicación porque los sustratos reales y las ventanas de proceso pueden cambiar mucho el resultado.
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| Glucoamilasa compuesta | 9032-08-0 |
| Pullulanasa | 9075-68-7 |
| Xilanasa | 37278-89-0 |
| Celulasa | 9012-54-8 |
| Naringinasa | 9068-31-9 |
| β-amilasa | 9000-91-3 |
| Glucosa oxidasa | 9001-37-0 |
| alfa-amilasa | 9000-90-2 |
| Pectinasa | 9032-75-1 |
| Peroxidasa | 9003-99-0 |
| Lipasa | 9001-62-1 |
| Catalase | 9001-05-2 |
| TANNASE | 9025-71-2 |
| Elastase | 39445-21-1 |
| Urease | 9002-13-5 |
| DEXTRANASE | 9025-70-1 |
| L-Láctica deshidrogenasa | 9001-60-9 |
| Malato de deshidrogenasa | 9001-64-3 |
| Colesterol oxidasa | 9028-76-6 |