¿Cuál es el proceso de producción de bioenzimas?

1. Producción de enzimas

Las enzimas se producen a partir de microorganismos, animales y plantas, pero la fuente principal son los microorganismos. Dado que los microorganismos tienen más ventajas que las plantas y los animales, generalmente se seleccionan cepas excelentes productoras de enzimas para producir enzimas mediante fermentación. Para aumentar la concentración de enzimas en el caldo de fermentación, se seleccionan cepas excelentes, se desarrollan bacterias modificadas genéticamente y se optimizan las condiciones de fermentación. La producción industrial necesita un rendimiento especial de nuevas enzimas, como la α-amilasa resistente a altas temperaturas, la proteasa y la lipasa resistentes a los álcalis, etc. Por lo tanto, necesitamos investigar y desarrollar cepas para producir un rendimiento especial de nuevas enzimas.

2. Preparación de enzimas

La tecnología de separación y purificación de enzimas es el núcleo del actual «proceso de postratamiento» biotecnológico. El uso de diversas técnicas de separación y purificación, desde células microbianas y su caldo de fermentación, o células animales y vegetales y su caldo de cultivo en la separación y purificación de enzimas, hechas de preparaciones enzimáticas altamente activas de diferente pureza, con el fin de hacer que las preparaciones enzimáticas se utilicen más ampliamente en todos los aspectos de la economía nacional, debe mejorar la actividad de las preparaciones enzimáticas, la pureza y el rendimiento, la necesidad de estudiar las nuevas técnicas de separación y purificación.

3. Inmovilización de enzimas y células

La investigación sobre la inmovilización de enzimas y células es la tarea central de la ingeniería enzimática. Con el fin de mejorar la estabilidad de las enzimas, reutilizar los preparados enzimáticos, ampliar el rango de aplicación de los preparados enzimáticos, utilizando una variedad de métodos de inmovilización para la inmovilización de enzimas, la preparación de enzimas inmovilizadas, como la glucosa isomerasa inmovilizada, la carbamoilasa inmovilizada, etc., la determinación de enzimas inmovilizadas y enzimas inmovilizadas para la aplicación de diversos aspectos del desarrollo de la investigación. La enzima inmovilizada sigue teniendo una gran vitalidad. Es muy valorada en diversos campos como la bioquímica, la ingeniería química, la microbiología, los polímeros y la medicina.

Las células inmovilizadas se desarrollan sobre la base de enzimas inmovilizadas. Se utilizan varios métodos de inmovilización para inmovilizar células microbianas, células animales y células vegetales para producir una variedad de células biológicas inmovilizadas. El estudio de las propiedades enzimáticas de las células inmovilizadas, especialmente las propiedades cinéticas, y la investigación y el desarrollo de células inmovilizadas en diversas aplicaciones es un tema candente en la ingeniería enzimática hoy en día.

La tecnología de inmovilización es un hito importante en la modernización de la tecnología enzimática, y es una tecnología innovadora para superar las deficiencias de las enzimas naturales en aplicaciones industriales y aprovechar al máximo las características de la reacción enzimática. Se puede decir que no existe una tecnología enzimática moderna sin el desarrollo de la tecnología de inmovilización.

4. Modificación molecular de enzimas

También conocida como modificación molecular de enzimas. Con el fin de mejorar la estabilidad de la enzima, reducir la antigenicidad, prolongar la vida media de las bacterias medicinales en el cuerpo, utilizando diversos métodos de modificación para modificar la estructura de la molécula enzimática, con el fin de crear una enzima natural que no tenga algunas características excelentes (como mayor estabilidad, ausencia de antigenicidad, resistencia a la hidrólisis de la proteasa, etc.), e incluso crear una nueva actividad enzimática, para ampliar la aplicación de la enzima, a fin de aumentar el valor de la aplicación enzimática y lograr mayores beneficios económicos y sociales. y beneficios sociales.

La modificación molecular de las enzimas puede llevarse a cabo desde dos aspectos:

(1) Utilizar la tecnología de ingeniería de proteínas para modificar el gen de la estructura de la molécula de la enzima, con la esperanza de obtener la nueva enzima (enzima mutante) con excelentes características y alta actividad que tenga una estructura primaria y una estructura espacial razonables.

(2) Modificación química o enzimática de la estructura primaria de las proteínas enzimáticas, o modificación química de la molécula enzimática con modificación química del grupo de la cadena lateral. Con el fin de cambiar las propiedades enzimáticas. Estas enzimas son particularmente útiles en la investigación básica en enzimología y en medicina.

Los microorganismos utilizados en la producción de enzimas son hongos filamentosos, levaduras y bacterias en tres grupos principales, principalmente con bacterias aeróbicas. Las cepas y usos de varias enzimas industriales importantes se enumeran a continuación:

Amilasa

Las amilasas hidrolizan el almidón para producir maltoligosacáridos pastosos y maltosa. La producción está dominada por la fermentación profunda con Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis del género Bacillus, este último produce enzimas resistentes al calor. Las fermentaciones profundas y semisólidas con cepas de Aspergillus y Rhizopus también se utilizan para el procesamiento de alimentos [6]. Las amilasas se utilizan principalmente en la producción de azúcar, el desencolado de textiles, el tratamiento de materias primas de fermentación y el procesamiento de alimentos. La glucoamilasa puede hidrolizar el almidón en glucosa, que ahora se produce casi en su totalidad mediante fermentación profunda de Aspergillus niger, y se utiliza en la producción de azúcar, la producción de alcohol y el procesamiento de materias primas de fermentación.

Proteasa

El uso de cepas y la producción de la mayoría de las variedades. Con bacilo en forma de liquen, bacilo corto y pequeño y bacilo subtilis para la producción de proteasa bacteriana por fermentación profunda; con estreptomicetos, producción de proteasa neutra por fermentación profunda de Aspergillus y proteasa ácida de Aspergillus, utilizada para el depilado del cuero, el ablandamiento de pieles, productos farmacéuticos, la industria alimentaria; con Trichoderma spp. Algunas de las bacterias en la fermentación semisólida producen cuajo en la fabricación de queso en lugar de cuajo extraído del estómago del ternero original.

Glucosa isomerasa

Especie desarrollada rápidamente en los años 70. Las células de Streptomyces se obtienen primero por fermentación profunda y, tras la inmovilización, la solución de glucosa se convierte en un jarabe que contiene aproximadamente un 50 % de fructosa, que puede utilizarse en la industria alimentaria en lugar de sacarosa. Con la amilasa, la glucoamilasa y la glucosa isomerasa, etc., se transforma el almidón de maíz en jarabe, lo que se ha convertido en una de las industrias azucareras emergentes.

Selección de sistemas de expresión
1. Sistema de expresión de E. coli
①Se prefiere el sistema de expresión pET
② La expresión y purificación de proteínas recombinantes se puede realizar utilizando etiquetas solubilizadas, se prefiere MBP como primera opción.
③ Preferiblemente pET24 o pET28 (si se necesita purificación) con BL21(DE3), medio TB, crecimiento a 37 °C hasta 1-1,5 DO, crecimiento a 18 °C durante 1 hora hasta 3 DO, inducción con IPTG 0,5 mM durante 19 horas hasta DO de hasta 10.
④ Medidas de rescate para alta expresión y baja solubilidad: enfriamiento hasta 15 ℃; cambio del medio a 2xYT o ZYP5052 (autoinducido), cambio del huésped de expresión; truncamiento de los residuos de aminoácidos 2-10 del N-terminal y/o C-terminal; expresión por fusión con proteínas altamente solubles, como MBP; inducción química de chaperonas moleculares, coexpresión de chaperonas moleculares/proteínas de interacción, o suministro de ligandos.
⑤ Ventajas y desventajas del sistema de expresión de E. coli
Ventajas: más conveniente, más eficaz
Desventajas: capacidad de expresión de secreción débil; dificultad en la formación de enlaces disulfuro; sin modificación postraduccional

2 Sistema de expresión de levadura (Picrosporum)
Ventajas: integración estable de genes exógenos; el promotor del gen de la alcohol oxidasa es fuerte y la expresión puede regularse estrictamente mediante metanol; las proteínas recombinantes pueden expresarse en formas intracelulares o extracelulares; contiene funciones de modificación postraduccional comunes a los sistemas de expresión eucariotas; existen huéspedes/vectores comerciales, que son fáciles de manejar; fácil de amplificar, y la densidad de fermentación es extremadamente alta.
② Desventajas: forma única de procesamiento postraduccional; problema de glicosilación excesiva.

3 La primera opción es el sistema de expresión descrito en la literatura, la segunda opción es el sistema E. coli, y el sistema de levadura se utiliza si la expresión en E. coli es inactiva. Según la fuente del gen para determinar el sistema de expresión, el gen más las etiquetas de afinidad para facilitar la purificación.

Modificación enzimática
①Diseño racional: basado en la estructura de la proteína y la información de la función sobre el cambio del gen codificador y la prueba de expresión de recombinación.
Procedimiento: en primer lugar, obtener la estructura de la enzima de la base de datos BRENDA, luego modificar la estructura de la enzima y predecir la estructura de la enzima con Alphafold2, luego hacer un análisis de acoplamiento entre la enzima y la molécula de ligando con el software PyMOL, y finalmente, de acuerdo con la nueva estructura de la enzima, mutar las secuencias genéticas direccionalmente, y luego expresarla de forma recombinante para obtener una nueva enzima (para mejorar la estabilidad térmica de la enzima, la eficiencia catalítica y la especificidad del sustrato).
② Diseño irracional: mutación de alta frecuencia o recombinación de secuencias codificantes y expresión recombinante y pruebas de alto rendimiento

Proceso de diseño ab initio: 1. desarrollo de campo de fuerza y algoritmo de muestreo 2. pruebas de alto rendimiento 3. identificación de estructuras

Evolución dirigida de proteínas
①Seleccionar genes originales
②Establecer una biblioteca de mutaciones de genes de diversidad
③Vincular múltiples genes mutados en vectores y expresarlos en cepas correspondientes respectivamente
④ Seleccionar un gen mutante de alta calidad mediante cribado y, a continuación, expresar el gen mutante en grandes cantidades.

Métodos de generación de bibliotecas de genes mutantes
①Mutación aleatoria de alta frecuencia in vivo: utilizar E. coli XL1-Red como huésped de replicación génica (sistema defectuoso de reparación de daños en el ADN)
Cultivado hasta la fase de meseta, se produce una mutación de 1 base en 2 Kb de media.
②Kit de mutagénesis aleatoria: tasa de mutación 0,1-1,6 %/PCR, equivalente a 1-16 mutaciones de base/gen
③ Mutagénesis de saturación punto por punto

Evolución natural: mutación espontánea, recombinación, selección natural
Evolución agrícola: mutación espontánea, cría, selección
Evolución de laboratorio: tasa de mutación acelerada, cría molecular, selección

Mezcla de ADN
Estrategia experimental de ingeniería de proteínas
①Seleccionar el gen inicial para establecer un sistema de inactivación y/o un método de cribado.
②Si se conoce la relación estructura-función, adoptar primero el método de diseño racional.
③Ajuste fino de mutaciones aleatorias y cribado de alto rendimiento.
④Diseñar desde cero solo si no hay un gen inicial adecuado.

Técnicas de investigación de proteínas
1 Propiedades físicas y químicas relacionadas con la separación y purificación de proteínas
Tamaño molecular (diálisis, ultrafiltración, filtración en gel, centrifugación).
②Forma molecular (centrifugación en gradiente, electroforesis)
(iii) Propiedades cargadas (electroforesis, cromatografía de intercambio iónico)
(iv) Propiedades de solubilización (salinización, precipitación con disolventes orgánicos)
⑤ Diferencias en la unión específica a ligandos (cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de bioafinidad, cromatografía de afinidad de quelatos metálicos)
(vi) Propiedades de adsorción (cromatografía hidrofóbica)
(vii) desnaturalización y desnaturalización (desnaturalización y desnaturalización de la urea)

2 Sistema de expresión de proteínas
① Sistema de expresión bacteriano: ciclo corto, alta eficiencia, bajo coste, pero sin modificación postraduccional. Se utiliza principalmente para la producción de proteínas procariotas, proteínas eucariotas simples.
Selección del vector de expresión: serie pet, serie pGEX, PQE30……
Selección de cepas de expresión: BL21(DE3), Rosetta, M15……
Condiciones de inducción: concentración de IPTG, temperatura y duración.
Purificación: Ni-NTA (etiqueta His), Strep-beads, GST…..

② Sistema de expresión de levadura: ciclo corto, alta eficiencia, bajo coste, existe modificación postraduccional. Habrá glicosilación inapropiada, alta modificación de manosa. Se utilizan principalmente para producir proteínas intracelulares/secretoras, proteínas de unión a disulfuro y proteínas glicosiladas.

(iii) Sistema de expresión de bacteriófagos: alta capacidad genética, proteínas solubles, adecuadas para la producción de proteínas tóxicas, modificaciones postraduccionales similares a las de los mamíferos. Las condiciones de cultivo son duras y carece de algunas modificaciones de glicosilación. Se utilizan principalmente para la producción de proteínas de membrana, proteínas de gran tamaño, vacunas virales, proteínas de señalización, citoquinas y quinasas.
El genoma del baculovirus tiene una enorme capacidad para inserciones de genes exógenos de hasta 38 kb.
Los baculovirus se producen en células de insectos y no se replican en células de mamíferos.
Ventajas: los baculovirus pueden transducirse eficazmente en líneas celulares de mamíferos, incluidas las células primarias y madre.
Seguridad (no se replica en células de mamíferos) y ausencia de efectos citopáticos observables.
Las células pretransducidas almacenadas congeladas también pueden utilizarse como células de preparación de pruebas.
Portabilidad (para el análisis de tipos de células farmacológicamente relevantes).
Rapidez en el desarrollo de pruebas (no es necesario dedicar tiempo a generar líneas celulares estables).

④ Sistemas de expresión de mamíferos: tiempo de ciclo largo, baja eficiencia, presencia de modificaciones postraduccionales, alta bioactividad proteica. Se utilizan principalmente para producir proteínas eucariotas complejas, proteínas que requieren PTM precisas.
Expresión transitoria de proteínas: reactivos de transfección PEI o liposomas
Desarrollo de líneas celulares estables: plataformas de ingeniería celular Flp-In™ Jump-In™
Expresión inducible: expresión regulada por tetraciclina
Expresión mediada por entrega viral: sistema de expresión lentiviral para análisis funcional; sistema de expresión adenoviral para producción de proteínas

3 Purificación de proteínas
¿Por qué necesitamos purificar proteínas?
Para caracterizar la estructura y función de las proteínas de interés.
(ii) Estudiar la regulación de las proteínas y las interacciones entre proteínas.
③ Generar anticuerpos.
Métodos de purificación
Basados en propiedades físicas/químicas
Tamaño de la proteína: diálisis, ultrafiltración, cromatografía de filtración en gel.
Carga de la proteína: cromatografía de intercambio iónico.
Hidrofobicidad de la proteína: cromatografía de interacción hidrofóbica.

Basados en propiedades biológicas: cromatografía de afinidad.

① Diálisis
Factores influyentes: MWCO del tubo de diálisis; volumen del tampón; tiempo de diálisis; frecuencia de sustitución del tampón de diálisis.

Ultrafiltración
Filtración centrífuga, el tamaño de la proteína es menor que el tamaño de los poros del tubo de filtro, se centrifuga hasta el fondo del tubo.

③ Cromatografía de filtración en gel
Separa proteínas de diferentes tamaños

④ Cromatografía de intercambio iónico
Columna de intercambio catiónico: el gel tiene carga negativa, la proteína tiene carga positiva
Columna de intercambio aniónico: el gel tiene carga positiva, la proteína tiene carga negativa
Medio
Soporte inerte: agarosa, dextrano
Grupos cargados: carboximetilo: carga negativa, dietilamino: carga positiva
Iones de equilibrio: grupos con carga negativa: H+ o Na+ grupos con carga positiva: OH- o Cl-
Elución gradual o en gradiente de proteínas mediante el aumento de la concentración de sal o el cambio de pH.

⑤ Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad es un método de separación de biomoléculas de una mezcla basado en interacciones de unión macromolecular altamente específicas entre una biomolécula y otra sustancia.
Algunos ejemplos son: unión de antígenos a anticuerpos, unión de enzimas a ligandos, unión de glutatión y proteínas de fusión GST, unión de proteínas anti-biotina a moléculas de unión a biotina y unión de iones metálicos a proteínas de fusión polihistidina.

Cromatografía de quelato metálico inmovilizado (IMAC) utilizando iones metálicos (Ni 2+; Co 2+; Cu 2+) unidos a proteínas marcadas con poli-(His) 6.

Purificación de proteínas marcadas con Strep-tag
Las bolas pueden adsorber específicamente proteínas con la etiqueta de estreptina, y luego con biotina la proteína puede ser eluida de las bolas. (El principio es similar al experimento de extracción de GST)

cromatografía de afinidad proteína A/proteína G
La proteína A y la proteína G modificadas genéticamente pueden unirse específicamente a la región Fc de la IgG de mamífero. Al unir la proteína A y la proteína G al material de la columna, la IgG y sus subclases y fragmentos pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad.
Proteína A: peso molecular de 42 kDa, codificada por el gen spa, con 5 dominios estructurales isotípicos de unión a inmunoglobulinas, cada uno de los cuales consta de 3 hélices alfa.
Proteína G: con un peso molecular de 65 kDa, codificada por el gen spg, se une a los segmentos Fc y Fab del anticuerpo, así como a la albúmina en el suero. La proteína G modificada genéticamente elimina el sitio de unión a la albúmina y retiene solo el dominio de unión Fc, que es más potente que la proteína A. La proteína A/proteína G es una proteína modificada genéticamente que se une a la albúmina.
proteína A/proteína G: es una proteína de unión modificada genéticamente. Consta de 4 dominios de unión a inmunoglobulina de la proteína A y 2 de la proteína G, que tiene un rango de unión más amplio que la proteína A o la proteína G por sí solas, y combina sus ventajas en una sola, que puede aplicarse a la purificación de IgG de casi todas las especies.

¿Cómo identificar la proteína purificada?
SDS-PAGE; HPLC; espectrometría de masas; Western blot; ensayos de unión; ensayos funcionales; elucidación estructural.

4 Microscopía electrónica
Microscopía crioelectrónica de partícula única (análisis de partícula única, SPA)
Microscopía de tomografía crioelectrónica (cryo-ET)

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Compound Glucoamylase	9032-08-0
Pullulanase	9075-68-7
Xylanase	37278-89-0
Cellulase	9012-54-8
Naringinase	9068-31-9
β-Amylase	9000-91-3
Glucose oxidase	9001-37-0
alpha-Amylase	9000-90-2
Pectinase	9032-75-1
Peroxidase	9003-99-0
Lipase	9001-62-1
Catalase	9001-05-2
TANNASE	9025-71-2
Elastase	39445-21-1
Urease	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-Lactic dehydrogenase	9001-60-9
Dehydrogenase malate	9001-64-3
Cholesterol oxidase	9028-76-6