Anteriormente mencionamos la conversión de rutina e isoquercitrina. Entre los diversos métodos de conversión, el que ofrece mayor rendimiento y pureza es el uso de métodos catalizados por enzimas, como la α-L-ramnosidasa de microorganismos y la hesperidinasa. La α-L-ramnosidasa se suele combinar con la β-D-glucosidasa para formar la naringinasa, que desempeña una función catalítica. En estudios anteriores, los investigadores equiparaban el concepto de «α-L-ramnosidasa» con el de «naringinasa». Así pues, veamos primero los conocimientos básicos sobre la naringinasa.
La naringinasa puede hidrolizar sustancias amargas como la naringina y la hesperidina presentes en los cítricos, por lo que se utiliza para eliminar el amargor de los zumos de cítricos, y recibe su nombre de ello. El principal componente amargo de los cítricos es la naringina, que puede ser degradada por la naringinasa en dos pasos: en el primer paso, la α-L-ramnosidasa hidroliza la naringina en ramnosa y prunina; en el segundo paso, la β-D-glucosidasa hidroliza aún más la prunina en naringenina y glucosa sin sabor amargo. El mecanismo de hidrólisis se muestra en la figura 1. Entre ellos, la purunina contiene solo un tercio del amargor.
Figura 1. Mecanismo de hidrólisis de la naringina por la naringinasa
Ya en 1938 y 1958, Hall y Ting obtuvieron naringinasa a partir de semillas de apio y hojas de pomelo, respectivamente. Posteriormente, otros investigadores obtuvieron naringinasa a partir de otros animales y plantas. Además de los animales y las plantas, la naringinasa está más ampliamente presente en los microorganismos. La naringinasa que se utiliza actualmente en la investigación y la producción industrial también se obtiene principalmente de microorganismos. Entre ellos, los hongos naturales son la principal fuente de naringinasa, como Aspergillus niger, Aspergillus oryzae y Penicillium. Una pequeña cantidad de naringinasa se obtiene de la levadura. Y algunas otras naringinasas se obtienen de bacterias, cuyas propiedades enzimáticas y ámbito de aplicación difieren mucho de las de los hongos. La tabla 1 muestra la naringinasa y sus propiedades de diferentes fuentes estudiadas por algunos investigadores.
Tabla 1 Naringinasa de diferentes fuentes y sus propiedades
Fuentes
Cepas
Sustrato
Temperatura óptima / °C
OptimumpH
Peso molecular /kDa
planta
Semillas de apio
Naringina
–
–
–
Hojas de pomelo
Naringina
50
4.0
–
Fagopyrum esculentum
p-NPR, rutina
–
–
70
animal
Turbo cornudo
Naringina, p-NPR, rutina
–
2.8, 4.5~5.0
–
Hígado de cerdo
diosgenina
42
7.0
47
bacterias
Sphingomonas sp. R1
Naringina
50
8.0
110
Thermomicrobium espécies.
p-NPR
70
7.9, 5.0~6.9
104, 107
Pediococcus acidilactici
p-NPR, rutina, hesperidina
50，70
5.5, 4.5
74, 241
Brevundimonas sp.
Naringina
20~37
6.0~7.0
–
Bifidobacterium dentium
p-NPR, naringina, rutina, poncirina, ginsenósido
35
6.0
100
hongo
Aspergillus negro
Naringina、Rutina、hesperidina
40~60
4.0~5.0
65
A. kawachii
Naringina, p-NPR, hesperidina
50
4.0
90
A. oryzae
Naringina、p-NPR、hesperidina、neohesperidina
45
5.0
23
Penicillium decumbens
Naringina, p-NPR, rutina
–
7.0
120
P. corilo-folo
Naringina, rutina
57
6.5
67
levadura
Pichia angusta
Naringina、Rutina、hesperidina、quercitrina
40
6.0
90
Criptococo laurentii
Naringina
–
–
–
Williopsis californica
Naringina
–
–
–
Al comparar las propiedades de la naringinasa derivada de bacterias y hongos en la Tabla 1, se puede observar que, aunque el peso molecular de la naringinasa derivada de hongos es inferior al de la derivada de bacterias, es más adecuada para reaccionar en condiciones ácidas, por lo que resulta adecuada para eliminar el amargor del zumo de cítricos; en cuanto a las naringinasas derivadas de bacterias, el pH óptimo para la glicosidasa es moderado o ligeramente alcalino, y presenta un rango de temperaturas de reacción más amplio y una buena estabilidad térmica.
Con la continua profundización de la investigación y el descubrimiento de naringinasa con diferentes propiedades, la enzima se ha utilizado ampliamente en medicina, alimentación y cosmética. La aplicación inicial fue la eliminación del amargor de los zumos cítricos. La naringina es la principal sustancia amarga de los zumos cítricos. Su umbral de amargor en agua y zumo es de aproximadamente 20 ppm, y en algunos zumos cítricos puede alcanzar los 50 ppm. Esto demuestra que cuando su contenido alcanza 1,5 ppm, provoca una sensación amarga. Por lo tanto, en el procesamiento de zumos de cítricos y otras frutas, el tratamiento para eliminar el amargor es un proceso indispensable. La naringinasa es una enzima de alta eficiencia que puede hidrolizar la naringina y otras sustancias amargas, y la naringinasa puede lograr bien el objetivo de eliminar el amargor. Huang Gaoling et al. utilizaron naringinasa para eliminar el amargor del zumo de pomelo y miel de Guanxi y lo hidrolizaron a 60 ℃ y pH 3,6 durante 100 minutos. La tasa de eliminación del amargor del zumo puede alcanzar más del 97 %. Chen Hong et al. utilizaron Aspergillus aculeatus JMUdb058 para obtener naringinasa mediante fermentación en estado sólido y la utilizaron para eliminar el amargor de zumos de frutas. La tasa de eliminación del amargor fue de hasta el 99,6 %, y se obtuvo un efecto muy bueno.
Al mismo tiempo, debido a que la naringinasa contiene α-L-ramnosidasa, puede utilizarse para producir específicamente ramnosa y purunina. La ramnosa es un tipo de metilpentosa. Puede utilizarse como intermediario farmacéutico para sintetizar cardiotónicos y especias como el furaneol. También puede sintetizar aromas y, al mismo tiempo, utilizarse como edulcorante. Además, puede utilizarse como agente de prueba de penetración intestinal. Tiene un efecto anticancerígeno evidente. Wei Shenghua et al. utilizaron naringinasa y células de levadura en reposo como catalizadores para transformar la naringina mediante un método biológico en dos etapas para preparar cristales de ramnosa con una fracción de masa superior al 98,5 %. La purunina, como tipo de flavonoide, tiene funciones únicas en el campo de las actividades inmunitarias, anticancerígenas, antivirales y antioxidantes. Por lo tanto, en el campo de la industria alimentaria y médica, la purunina tiene un importante valor aplicativo. Hu Qunfang y otros utilizaron la fermentación en estado sólido para producir α-L-ramnosidasa y llevaron a cabo la biotransformación de la naringina en condiciones adecuadas, y el contenido de purunina en el producto fue superior al 95 %.
Además, gracias a la actividad reactiva de la naringinasa, esta puede utilizarse para mejorar el sabor del vino. En el proceso de elaboración del alcohol, diversos microorganismos producen algunas sustancias volátiles libres y precursores no volátiles. La α-L-ramnosidasa descompone primero estos precursores no volátiles para obtener β-D-glucósido monoterpenoide, y luego la β-D-glucosidasa continúa la descomposición para liberar monoterpenoides, que tienen un efecto significativo en la mejora del sabor del vino. Manzanares et al. utilizaron el gen rha A de la rhamnosidasa codificado por Aspergillus aculeatus para clonarlo y expresarlo en levadura, y lo utilizaron junto con la β-D-glucosidasa producida por otras cepas para la fermentación del vino, lo que dio lugar a un aumento significativo de las sustancias aromáticas en el vino. Los datos específicos se muestran en la imagen 2.
Figura 2. Aplicación de la naringinasa en la fermentación del vino
Además, la naringinasa también se puede utilizar para producir antibióticos y convertir flavonoides. Por ejemplo, la cloropoliesporina es un antibiótico glicopéptido desglucosilado que tiene una fuerte respuesta inhibidora frente a las bacterias Gram-positivas. Sankyo et al. descubrieron que la actividad de la ramnosidasa en la naringinasa puede utilizarse para sintetizar el antibiótico, y observaron que el uso combinado de antibióticos cloropolysporina C y antibióticos lactámicos puede potenciar eficazmente su efecto antibacteriano sobre el Staphylococcus. Beekwilder et al. obtuvieron ramnosidasa a partir de una bacteria láctica Lactobacillus plantarum y utilizaron la enzima en la fermentación de pulpa de tomate. Descubrieron que puede eliminar la ramnosa de la pulpa de tomate y mejorar la reacción de biotransformación de los flavonoides. Por lo tanto, las bacterias del ácido láctico pueden aumentar la tasa de biotransformación de los flavonoides en el sistema digestivo humano. Hu Fuliang et al. descubrieron que los glucósidos de flavona del propóleo pueden ser degradados por la naringinasa para sintetizar agliconas, mejorando así su actividad antioxidante.
En resumen, la naringinasa tiene unas perspectivas de aplicación muy amplias. Con el fin de aumentar la reutilización y la estabilidad de la naringinasa y reducir los costes de producción industrial, la naringinasa se fija generalmente a un soporte antes de la reacción. En el próximo artículo, nos centraremos en el método de fijación de la enzima para su referencia.
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