Modificación de cepas productoras de proteasa
Respuesta rápida: Las enzimas y los ingredientes de procesamiento de alimentos generalmente se seleccionan según el ajuste del sustrato, el intervalo de pH y temperatura, la dosis y si la especificación de uso final es aceptable para el proceso objetivo. La opción comercial más sólida es aquella que funciona consistentemente en condiciones de procesamiento reales.
La proteasa es una clase de enzima que cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos en proteínas, que se encuentra ampliamente en animales, plantas y microorganismos, y es una de las preparaciones enzimáticas más utilizadas en especies de enzimas industriales, representando aproximadamente el 60% de la cantidad total de enzimas. Las fuentes microbianas de proteasas son abundantes, diversas y fáciles de producir, convirtiéndose en la principal fuente de proteasas del mercado. La producción comercial de proteasa se remonta a principios del siglo pasado, en 1908 los alemanes comenzaron a utilizar enzimas pancreáticas para curtir cuero, en 1911 la empresa estadounidense Wallerstein produjo papaína como agente clarificante para la cerveza. A principios de los años sesenta, los Países Bajos producían detergentes con proteasa añadida. Además, también se combina con la práctica para llevar a cabo la selección y reproducción de bacterias de producción de proteasas resistentes al calor, resistentes a los ácidos y resistentes a la sal, así como la producción de fermentación de petróleo como materia prima para la investigación de proteasas alcalinas.
Hay muchos tipos de proteasas y su peso molecular, tamaño, estructura espacial y función son muy diferentes, pero cada familia de proteasas aún mantiene un dominio estructural altamente conservado. En la actualidad, se han cristalizado o altamente purificados más de 100 tipos de proteasas, y muchas de ellas se han dilucidado en términos de sus estructuras primaria y estéreo (estructura terciaria).
2 Modificación de cepas de proteasa
La construcción de bacterias diseñadas para la expresión eficiente de la proteasa y la optimización de sus propiedades enzimáticas ha sido el punto de interés de los estudiosos nacionales y extranjeros, y los medios utilizados habitualmente son: reproducción por mutaciones, fusión protoplásmica, construcción de bacterias modificadas genéticamente y tecnología de evolución direccional in vitro.
2.1 Reproducción por mutagénesis y fusión protoplásmica.
El mejoramiento por mutagénesis se realiza principalmente mediante mutagénesis por radiación o algunos reactivos químicos para inducir mutaciones en el material genético de la bacteria para obtener cepas mutantes con rasgos excelentes. Por ejemplo, después de la mutagénesis UV de cepas productoras de enzimas realizada por Cai Wanling et al, su actividad enzimática aumentó en un 16% en comparación con la cepa original. Yanli Li et al.examinaron la actividad de la enzima productora de proteasa neutra de Aspergillus oryzae ZW-06 hasta 15.000 U/g de cuajada seca mediante mutagénesis dirigida por Co60, que era un 74% mayor que antes de la mutagénesis. Huang Hongying et al. combinaron tecnología de implantación de iones N+ de baja energía en Bacillus licheniformis de tipo salvaje cuatro veces con diferentes medios fisicoquímicos de mutagénesis, para obtener una cepa de alto rendimiento, con una actividad enzimática bruta de 12425,9 U/mL, 17,1 veces mayor que la cepa de partida.
La tecnología de fusión protoplásmica es un proceso en el que a las células de una cepa biparental se les quitan las paredes para la fusión protoplásmica, a fin de intercambiar y recombinar sus genomas para obtener recombinantes estables. Por ejemplo, Pan Yanyun et al. utilizaron el método de fusión protoplásmica para fusionar Bacillus licheniformis 2709 con Bacillus subtilis BD105, que contiene el vector de clonación del gen de proteasa alcalina pDW2, para obtener una cepa A16 de alto rendimiento, con una producción de enzimas de fermentación entre un 50% y un 100% superior a la de 2709, y una producción de enzimas de hasta 30.000 U/mL en la prueba del matraz agitado.
2.2 Construcción de bacterias de ingeniería genética.
La construcción de bacterias de ingeniería requiere normalmente huéspedes de expresión y vectores de expresión o elementos de expresión adecuados. En primer lugar, el gen diana se clona en el vector de expresión para obtener el vector recombinante, luego se transforma en el huésped de expresión mediante el proceso de selección y finalmente se obtiene el proceso de cepa de alto rendimiento. También es posible integrar los fragmentos exógenos del gen diana directamente en el genoma del huésped para obtener cepas de alto rendimiento.
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Min Zhang et al. ligó la secuencia del péptido señal promotor ( sacR ) del gen sacB con el gen de la proteasa neutra de Bacillus subtilis y la clonó en el vector pHP13, construyó el vector de secreción de expresión inducible pHP13SN que contiene el gen de la proteasa neutra y luego lo transformó en Bacillus subtilis DB104, que mostró un aumento del 48% en la viabilidad de la enzima en comparación con la de la cepa de salida. WangHui et al. Se clonó Banpr, una proteasa neutra de Bacillus amyloliquefaciens K11, y se construyó un plásmido de expresión recombinante, pUB110-Banpr, con Bacillus amyloliquefaciens K11 como huésped de expresión, y la actividad enzimática en la fermentación en matraz con agitación alcanzó 8995 ± 250 U/mL, y 28084 ± 1282 U/mL en la fermentación de 15 L. sistema, que era mucho más que el de la cepa industrial Bacillus subtilis AS.1398 (8000-10000 U/mL).
2.3 Mejora de las propiedades de la proteasa.Con el desarrollo de técnicas de evolución dirigida in vitro, se pueden obtener proteínas con funciones mejoradas o novedosas mediante mutación aleatoria de genes codificantes, técnicas de DNAShuffling y cribado dirigido sin el conocimiento de la información estructural tridimensional y el mecanismo de acción de la proteína diana.
La estabilidad enzimática es un factor clave en el éxito de la comercialización. La estabilidad de la enzima se puede mejorar introduciendo puentes salinos, enlaces disulfuro, interacciones aromáticas y aumentando la afinidad de la enzima por los iones de calcio, aumentando así la rigidez de la molécula mediante mutagénesis dirigida. La sustitución de Gly61 o Ser98 de la proteasa BPN’ por Cys, y de ambas, dio como resultado un aumento de la estabilidad térmica de la enzima sin un cambio en la eficiencia catalítica.
Al reemplazar Val72 con Ile, Ala92 con Thr y Gly131 con Asp de la proteasa de B. subtilis, la enzima mutante puede catalizar una actividad del sustrato 2 veces mayor que la de la enzima salvaje a 10 °C. En 2005, la empresa danesa Novozymes introdujo una proteasa de baja temperatura, «Polarzyme», que se puede añadir al detergente. Al agregarlo al detergente, la temperatura de lavado disminuyó de 60°C y 40°C a 30°C y 20°C, ahorrando un 60% de energía eléctrica, y el volumen de ventas del detergente “carecoldwash” con proteasa de baja temperatura aumentó siete veces.
3 perspectiva
Las proteasas se han utilizado en una variedad de campos que están estrechamente relacionados con nuestra vida diaria, y este entorno impone altas exigencias a la producción y caracterización de proteasas. Por lo tanto, la comprensión profunda del mecanismo catalítico de la proteasa, la relación entre la estructura espacial y la función catalítica y la modificación direccional de las cepas productoras de enzimas para cumplir con los requisitos de la producción industrial siguen siendo la tendencia de desarrollo de la ingeniería enzimática en el futuro. Además, además de la selección y reproducción de buenas cepas, se deben hacer esfuerzos para intentar construir nuevos sistemas de expresión o múltiples sistemas de coexpresión de genes de proteasas, para construir más vectores de expresión para proteasas, a fin de lograr la expresión efectiva de diferentes componentes y mejorar aún más la cantidad de expresión, la actividad enzimática y la estabilidad de la enzima.
Cómo suelen evaluar los compradores las enzimas y los ingredientes de procesamiento de alimentos
En proyectos de procesamiento de alimentos y enzimas, el marco de decisión más útil suele ser el ajuste de la aplicación más la estabilidad del proceso: qué ingrediente funciona bajo las condiciones de pH, temperatura, tiempo y sustrato previstas sin crear un problema de cumplimiento o calidad posterior.
- Defina primero el objetivo de procesamiento: Las aplicaciones de sabor, hidrólisis, textura, fermentación, limpieza y bioprocesos a menudo necesitan perfiles de actividad muy diferentes.
- Compruebe la ventana operativa real: El pH, la temperatura, el tiempo de residencia y el tipo de sustrato a menudo importan más que la afirmación principal del producto.
- Revisar la consistencia y el impacto posterior:La dosificación de , la influencia sensorial, la filtración y el comportamiento de la vida útil pueden afectar el valor comercial final.
- Utilice validación piloto:Las pruebas de producción pequeñas de generalmente revelan las diferencias más útiles en actividad, eficiencia y ajuste del proceso.
Referencias de productos recomendados
- Longzyme Lipasa: Una referencia directa del producto para debates sobre alimentos, limpieza o bioprocesos relacionados con la lipasa.
- Longzyme Beta-Amylase: Una referencia práctica de enzimas cuando se están revisando la conversión del almidón y la actividad de procesamiento de alimentos.
- Glucoamilasa compuesta de longzima: Una referencia enzimática útil cuando la sacarificación o el rendimiento del procesamiento relacionado son importantes.
- YExtracto de levadura: Una referencia práctica de ingredientes cuando se trata de aplicaciones de sabor, fermentación o soporte de nutrientes.
Preguntas frecuentes para compradores y formuladores
¿Por qué una enzima de alta actividad no es automáticamente la mejor opción comercial?
Porque la mejor enzima es la que funciona de manera confiable en las condiciones reales del proceso y proporciona el resultado final deseado sin crear nuevos problemas.
¿Deben seleccionarse los ingredientes alimentarios y biotecnológicos únicamente a partir de hojas de datos?
Por lo general, es más seguro combinar la revisión de especificaciones con una prueba piloto o de aplicación porque los sustratos reales y las ventanas de proceso pueden cambiar mucho el resultado.
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| Glucoamilasa compuesta | 9032-08-0 |
| Pullulanasa | 9075-68-7 |
| Xilanasa | 37278-89-0 |
| Celulasa | 9012-54-8 |
| Naringinasa | 9068-31-9 |
| β-amilasa | 9000-91-3 |
| Glucosa oxidasa | 9001-37-0 |
| alfa-amilasa | 9000-90-2 |
| Pectinasa | 9032-75-1 |
| Peroxidasa | 9003-99-0 |
| Lipasa | 9001-62-1 |
| Catalase | 9001-05-2 |
| TANNASE | 9025-71-2 |
| Elastase | 39445-21-1 |
| Urease | 9002-13-5 |
| DEXTRANASE | 9025-70-1 |
| L-Láctica deshidrogenasa | 9001-60-9 |
| Malato de deshidrogenasa | 9001-64-3 |
| Colesterol oxidasa | 9028-76-6 |