Modificación de cepas productoras de proteasa
La proteasa es una clase de enzima que cataliza la hidrólisis de los enlaces peptídicos en las proteínas, que se encuentra ampliamente en animales, plantas y microorganismos, y es una de las preparaciones enzimáticas más utilizadas en especies enzimáticas industriales, representando alrededor del 60 % de la cantidad total de enzimas. Las fuentes microbianas de proteasas son abundantes, diversas y fáciles de producir, convirtiéndose en la principal fuente de proteasas en el mercado. La producción comercial de proteasa se remonta a principios del siglo pasado. En 1908, los alemanes comenzaron a utilizar la enzima pancreática para curtir el cuero. En 1911, la empresa estadounidense Wallerstein produjo papaína como agente clarificante para la cerveza. A principios de los años sesenta, los Países Bajos produjeron detergentes con la adición de proteasa. Además, también se combinó con la selección y reproducción de bacterias para la producción de proteasas resistentes al calor, a los ácidos y a la sal, así como con el petróleo como materia prima para la producción de fermentación de proteasas alcalinas.
Hay muchos tipos de proteasas, y su tamaño de peso molecular, estructura espacial y función son muy diferentes, pero cada familia de proteasas mantiene un dominio estructural altamente conservado. En la actualidad, se han cristalizado o purificado en gran medida más de 100 tipos de proteasas, y se han dilucidado muchas de ellas en términos de sus estructuras primaria y estereo (estructura terciaria).
2. Modificación de cepas de proteasas
La construcción de bacterias de ingeniería para la expresión eficiente de la proteasa y la optimización de sus propiedades enzimáticas han sido el centro de atención de académicos nacionales y extranjeros, y los medios utilizados habitualmente son: fitomejoramiento por mutación, fusión protoplasmática, construcción de bacterias modificadas genéticamente y tecnología de evolución direccional in vitro.
2.1 Fitomejoramiento por mutagénesis y fusión protoplasmática
La mutagénesis se realiza principalmente mediante mutagénesis por radiación o algunos reactivos químicos para inducir mutaciones en el material genético de la bacteria y obtener cepas mutantes con excelentes características. Por ejemplo, tras la mutagénesis UV de cepas productoras de enzimas por Cai Wanling et al., su actividad enzimática aumentó un 16 % en comparación con la cepa original. Yanli Li et al. examinaron la actividad enzimática productora de proteasa neutra de Aspergillus oryzae ZW-06 hasta 15 000 U/g de cuajada seca mediante mutagénesis dirigida por Co60, que fue un 74 % superior a la anterior a la mutagénesis. Huang Hongying et al. combinaron la tecnología de implantación de iones N+ de baja energía en el Bacillus licheniformis de tipo salvaje durante cuatro veces con diferentes medios fisicoquímicos de mutagénesis, para obtener una cepa de alto rendimiento, la actividad enzimática bruta de 12425,9 U/mL, 17,1 veces mayor que la cepa de partida.
La tecnología de fusión protoplasmática es un proceso en el que las células de una cepa biparental se separan para la fusión protoplasmática, con el fin de intercambiar y recombinar sus genomas para obtener recombinantes estables. Por ejemplo, Pan Yanyun et al. utilizaron el método de fusión protoplasmática para fusionar Bacillus licheniformis 2709 con Bacillus subtilis BD105, que contiene el vector de clonación del gen de la proteasa alcalina pDW2, para obtener una cepa A16 de alto rendimiento, con una producción de enzimas de fermentación entre un 50 % y un 100 % superior a la de 2709, y una producción de enzimas de hasta 30 000 U/mL en la prueba del matraz agitado.
2.2 Construcción de bacterias de ingeniería genética
La construcción de bacterias de ingeniería suele requerir huéspedes de expresión adecuados y vectores de expresión o elementos de expresión. En primer lugar, el gen diana se clona en el vector de expresión para obtener el vector recombinante, luego se transforma en el huésped de expresión, mediante el proceso de cribado, y finalmente se obtiene el proceso de cepa de alto rendimiento. También es posible integrar los fragmentos de genes diana exógenos directamente en el genoma del huésped para obtener cepas de alto rendimiento.
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Min Zhang et al. ligaron la secuencia promotora-péptido señal (sacR) del gen sacB con el gen de la proteasa neutra de Bacillus subtilis y la clonaron en el vector pHP13, construyeron el vector de secreción de expresión inducible pHP13SN que contenía el gen de la proteasa neutra, y luego lo transformaron en Bacillus subtilis DB104, que mostró un aumento del 48 % en la viabilidad de la enzima en comparación con la cepa de partida. WangHui et al. clonaron Banpr, una proteasa neutra de Bacillus amyloliquefaciens K11, y construyeron un plásmido de expresión recombinante, pUB110-Banpr, con Bacillus amyloliquefaciens K11 como huésped de expresión, y la actividad enzimática en la fermentación en matraz de agitación alcanzó 8995 ± 250 U/mL, y 28084 ± 1282 U/mL en un sistema de fermentación de 15 L, que era mucho mayor que la de la cepa industrial Bacillus subtilis AS.1398 (8000-10000 U/mL).
2.3 Mejora de las propiedades de la proteasa
Con el desarrollo de técnicas de evolución dirigida in vitro, se pueden obtener proteínas con funciones mejoradas o nuevas mediante la mutación aleatoria de genes codificadores, técnicas de DNAShuffling y cribado dirigido sin el conocimiento de la información estructural tridimensional y el mecanismo de acción de la proteína diana.
La estabilidad enzimática es un factor clave para el éxito de la comercialización. La estabilidad enzimática puede mejorarse introduciendo puentes salinos, enlaces disulfuro, interacciones aromáticas y aumentando la afinidad de la enzima por los iones de calcio, lo que aumenta la rigidez de la molécula mediante mutagénesis dirigida. La sustitución de Gly61 o Ser98 de la proteasa BPN’ por Cys, y de ambas, dio lugar a un aumento de la estabilidad térmica de la enzima sin un cambio en la eficiencia catalítica.
Al sustituir Val72 por Ile, Ala92 por Thr y Gly131 por Asp de la proteasa de B. subtilis, la enzima mutante puede catalizar la actividad del sustrato 2 veces superior a la de la enzima silvestre a 10 °C. En 2005, la empresa danesa Novozymes introdujo una proteasa de baja temperatura, «Polarzyme», que puede añadirse al detergente. Al añadirla al detergente, la temperatura de lavado disminuyó de 60 °C y 40 °C a 30 °C y 20 °C, ahorrando un 60 % de energía eléctrica, y el volumen de ventas del detergente «carecoldwash» con proteasa de baja temperatura se multiplicó por siete.
3 Perspectivas
Las proteasas se han utilizado en diversos campos estrechamente relacionados con nuestra vida cotidiana, y este entorno impone grandes exigencias a la producción y caracterización de las proteasas. Por lo tanto, la tendencia de desarrollo de la ingeniería enzimática en el futuro sigue siendo la comprensión en profundidad del mecanismo catalítico de la proteasa, la relación entre la estructura espacial y la función catalítica, y la modificación direccional de las cepas productoras de enzimas para satisfacer los requisitos de la producción industrial. Además, aparte de la selección y el cultivo de buenas cepas, se deben realizar esfuerzos para intentar construir nuevos sistemas de expresión o sistemas de coexpresión de múltiples genes de proteasas, para construir más vectores de expresión para proteasas, con el fin de lograr la expresión efectiva de diferentes componentes y mejorar aún más la cantidad de expresión, la actividad enzimática y la estabilidad enzimática.
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| Compound Glucoamylase | 9032-08-0 |
| Pullulanase | 9075-68-7 |
| Xylanase | 37278-89-0 |
| Cellulase | 9012-54-8 |
| Naringinase | 9068-31-9 |
| β-Amylase | 9000-91-3 |
| Glucose oxidase | 9001-37-0 |
| alpha-Amylase | 9000-90-2 |
| Pectinase | 9032-75-1 |
| Peroxidase | 9003-99-0 |
| Lipase | 9001-62-1 |
| Catalase | 9001-05-2 |
| TANNASE | 9025-71-2 |
| Elastase | 39445-21-1 |
| Urease | 9002-13-5 |
| DEXTRANASE | 9025-70-1 |
| L-Lactic dehydrogenase | 9001-60-9 |
| Dehydrogenase malate | 9001-64-3 |
| Cholesterol oxidase | 9028-76-6 |