¿Cuál es el enfoque de la química computacional en la investigación de enzimas industriales?
Respuesta rápida: Una decisión práctica sobre enzimas o ingredientes alimentarios comienza con el objetivo del proceso, luego verifica la actividad, la ventana de aplicación, el impacto sensorial y la consistencia entre lotes antes de ampliarlo.
El artículo presenta los principales métodos de química computacional utilizados en la investigación de enzimas industriales, especialmente para guiar la ingeniería de enzimas, incluidas simulaciones de dinámica molecular y campos de fuerza de mecánica molecular, mecánica cuántica y modelado combinado de mecánica cuántica/mecánica molecular, modelado electrostático continuo y acoplamiento molecular. Estos métodos se resumen en el texto desde dos perspectivas, respectivamente: primero, los conceptos básicos de los métodos mismos, los resultados de los cálculos originales, las condiciones de aplicabilidad y las ventajas y desventajas; y segundo, la valiosa información obtenida de los cálculos para guiar el diseño de mutantes y bibliotecas de mutantes.
La aplicación industrial de las enzimas tiene una historia de cien años, y la catálisis enzimática se usa ampliamente en diferentes industrias como la alimentaria, la agricultura, la medicina y la industria química debido a su alta eficiencia, alta especificidad y selectividad y respeto al medio ambiente [1-2]. Dado que el entorno de aplicación industrial es muy diferente del entorno en el que viven las enzimas en la naturaleza, la naturaleza y la función catalítica de las enzimas naturales y su entorno de aplicación generalmente no coinciden o no son óptimos. En este caso, es necesario modificar la secuencia de aminoácidos naturales de la enzima con la ayuda de ingeniería enzimática para mejorar su rendimiento. [3]. La estrategia de ingeniería enzimática más comúnmente utilizada es construir bibliotecas de mutaciones para la detección, es decir, evolución dirigida en laboratorio [4]. Uno de los requisitos previos necesarios para una evolución dirigida eficaz es que la capacidad de la biblioteca (es decir, el número de mutantes contenidos en la biblioteca) de la biblioteca de mutantes que se somete a selección es suficientemente grande en relación con la proporción de mutantes potencialmente beneficiosos en la biblioteca. El tamaño de una biblioteca de mutantes suele estar limitado por el método de detección, los recursos disponibles y otras condiciones objetivas. La cuestión clave es cómo aumentar el porcentaje de mutantes eficaces en la biblioteca de mutantes. Una comprensión profunda de la relación entre la secuencia de enzimas, la estructura y propiedades importantes puede ayudar a identificar puntos críticos de mutación, limitar el alcance de la mutación y lograr un diseño de biblioteca de mutantes de calidad.Los métodos de química computacional son un medio importante para lograr esta comprensión. Se ha demostrado que las bibliotecas de mutaciones de proteínas diseñadas computacionalmente basadas en el diseño computacional pueden aumentar el porcentaje de mutantes efectivos en varios órdenes de magnitud en relación con las bibliotecas de mutaciones aleatorias [5].. Para algunos temas difíciles de ingeniería enzimática o ingeniería de proteínas, la mejora sustancial que puede aportar la computación puede ser suficiente para determinar el éxito o el fracaso final del tema, que ya no se limita a la mejora de la eficiencia. De hecho, los métodos de química computacional y biología computacional han permitido diseñar con éxito enzimas artificiales desde cero con funciones catalíticas que las enzimas naturales no poseen. Dado que otras revisiones de este álbum se han dedicado a métodos para el diseño óptimo automatizado de secuencias de aminoácidos, este artículo se centrará en métodos computacionales para simular y analizar enzimas con una secuencia de aminoácidos determinada. Por supuesto, los investigadores pueden utilizar estos métodos para estudiar los tipos salvajes y los mutantes por separado y luego comparar los resultados.
El estudio de proteínas, especialmente enzimas, ha sido durante mucho tiempo una frontera importante de la investigación en química computacional [6-8]. Los métodos principales incluyen simulaciones de dinámica molecular (MD clásica) basadas en campos de fuerza de la mecánica molecular clásica [9], mecánica cuántica (QM) [10] y métodos combinados de mecánica cuántica/mecánica molecular (QM/MM) [8,11-12], predicción de complejos intermoleculares, es decir, acoplamiento molecular (Docking) [13] y modelo continuo polarizable (PCM) para cuantificar efectos electrostáticos y solventes [ 14].) como el modelo de Poisson-Boltzmann (PB) [14], y algunos modelos basados en propiedades geométricas. En este artículo, brindaremos una descripción general de cada uno de estos métodos desde dos perspectivas: primero, sobre los métodos en sí, incluidos los principios básicos, los resultados computacionales originales, las condiciones de aplicabilidad y las (potenciales) ventajas y desventajas, etc.; y segundo, sobre cómo utilizar estos métodos para obtener información relevante para la ingeniería, como una comprensión más profunda de mecanismos catalíticamente relevantes, predicciones teóricas o explicaciones de cambios en las propiedades o funciones de diferentes mutantes con respecto al tipo salvaje, que pueden guiar el diseño de bibliotecas de mutaciones de alta calidad para la evolución dirigida, o el diseño de bibliotecas de mutaciones de alta calidad, o el diseño de bancos de mutaciones.diseño de bibliotecas de mutaciones de alta calidad, o sugerencia de sitios de mutación específicos y tipos de mutaciones basados en el análisis de resultados computacionales sin procesar, etc.
1
Simulación de dinámica molecular (MD) basada en campos de fuerza de la mecánica molecular clásica (MM)
1.1
Introducción al método
Por el momento no consideramos los cambios químicos involucrados en la catálisis enzimática, sino solo los procesos de cambios conformacionales de la enzima, formación y disociación de complejos no covalentes entre la enzima y los reactivos (o productos) debido al movimiento térmico molecular. Durante estos procesos, el estado electrónico de la molécula no cambia (por ejemplo, no se rompen ni se crean enlaces covalentes) y se aplica el modelo de campo de fuerza de la mecánica molecular. El llamado campo de fuerza de la mecánica molecular es una función matemática empírica que expresa la dependencia de la energía potencial de un sistema molecular de la configuración geométrica (es decir, las coordenadas espaciales de todos los átomos que forman el sistema molecular) (Fig. 1A). En otras palabras, si usamos X para representar las coordenadas espaciales de todos los átomos y VMM (X) para representar la energía potencial del campo de fuerza molecular, la energía potencial cambia a medida que la molécula cambia de una conformación X1 a otra X2:
∆VMM = VMM ( X2 ) – VMM ( X1 ).
Según la teoría termodinámica, los átomos de una molécula están siempre en movimiento térmico, es decir, X cambia constantemente con el tiempo; es más, cuando hacemos observaciones experimentales, la muestra siempre consta de un gran número de moléculas (con excepción de los experimentos de una sola molécula), con diferentes moléculas en diferentes estados conformacionales. Por lo tanto, desde un punto de vista cinético, debemos considerar los cambios conformacionales a lo largo del tiempo, y desde un punto de vista termodinámico, debemos considerar la distribución de probabilidad de moléculas con diferentes conformaciones. La simulación de dinámica molecular (MD) es el modelo más sencillo para examinar estos dos aspectos de las propiedades (Fig. 1B).En la simulación MD, partimos de una conformación inicial, calculamos la fuerza que actúa sobre cada átomo en cada momento en función de la conformación actual y la función de energía potencial (la fuerza es la derivada negativa de la función de energía potencial con respecto a las coordenadas de los átomos), integramos numéricamente las ecuaciones de movimiento de Newton para obtener la conformación en el siguiente momento y repetimos el proceso para obtener la trayectoria de la evolución de la conformación a lo largo del tiempo.
Entretanto, se pueden utilizar algoritmos especiales para simular el efecto de factores ambientales (por ejemplo, temperatura, presión, etc.) sobre el movimiento molecular. Según el principio termodinámico, cuando el intervalo de tiempo es lo suficientemente largo, la distribución de probabilidad de la conformación de la misma molécula en diferentes puntos de tiempo y la conformación de diferentes moléculas en el estado de equilibrio termodinámico son las mismas (es decir, el promedio de tiempo es equivalente al promedio del sistema). Por lo tanto, si la simulación MD se realiza durante un período de tiempo suficientemente largo, el conjunto de conformaciones obtenidas de la simulación se puede utilizar como muestra de la distribución de conformaciones moleculares en un estado de equilibrio termodinámico particular. Con base en este principio, podemos analizar propiedades observables arbitrarias de un sistema en su estado de equilibrio termodinámico en función de las trayectorias temporales obtenidas por MD.
MD proporciona una poderosa herramienta computacional para analizar exhaustivamente el proceso de cambio cinético de cambios conformacionales e importantes distribuciones termodinámicas cuánticas microscópicas con resolución atómica, lo cual es particularmente importante para dilucidar los principios de diseño y los mecanismos de trabajo de máquinas biomacromoleculares complejas como las enzimas. Dado que los métodos experimentales actuales para el análisis de estructuras macromoleculares solo pueden proporcionar estructuras estáticas promediadas espacio-temporalmente, las simulaciones MD tienen una función irreemplazable en la investigación relacionada. Bajo esta premisa, la propia herramienta MD todavía se encuentra en proceso de mejora y refinamiento continuo. Metodológicamente, las principales limitaciones de la MD provienen de dos aspectos: primero, la precisión del modelo de campo de fuerzas moleculares; y segundo, el tiempo limitado de simulación dificulta la realización del muestreo completo del espacio conformacional. Para el primer problema, el campo de fuerza molecular ha mejorado enormemente en los últimos años y se ha aumentado la precisión de la descripción termodinámica del equilibrio conformacional de las macromoléculas biológicas, especialmente los sistemas de proteínas, simulando con éxito una variedad de moléculas de proteínas desde el proceso de plegamiento de la cabeza hasta la estructura natural [15-16]. En términos de tiempo de simulación, debido al desarrollo de hardware y software, ahora es posible realizar simulaciones del orden de microsegundos para sistemas de tamaño habitual (por ejemplo, moléculas de enzima de cientos de residuos en solución acuosa) utilizando hardware informático convencional (por ejemplo, servidores multinúcleo utilizados por el grupo). En esta escala de tiempo se pueden observar procesos como la apertura y cierre de dominios estructurales o regiones anulares. Si hay más recursos computacionales disponibles, también se pueden realizar simulaciones directas de procesos como la unión/disociación de sustratos. Para estudiar procesos en escalas de tiempo más allá del alcance de la simulación (por ejemplo, cambios funcionales a gran escala de proteínas alostéricas, etc.), se pueden utilizar métodos de muestreo mejorados [17], siempre que el usuario tenga una comprensión más profunda de la teoría MD.
Actualmente, la mayoría de las aplicaciones de simulación MD cubren escalas de tiempo desde nanosegundos a microsegundos, y el muestreo del espacio conformacional está restringido principalmente a la vecindad de la estructura inicial (para proteínas de dominio único, generalmente es el ascenso y descenso estructural del desplazamiento cuadrático medio (RMS) en el rango de 3-4 Å). Por lo tanto, es necesario utilizar una estructura inicial razonable como entrada al MD para que los resultados de la simulación sean significativos. En la mayoría de los casos, como estructuras iniciales para la MD se utilizan estructuras cristalinas determinadas experimentalmente o basadas en modelos comparativos de proteínas homólogas. Al simular complejos enzima-sustrato, a menudo es necesario modelar la estructura inicial del complejo basándose en la estructura de la enzima vacía o de la enzima en complejo con otras moléculas, ya sea mediante el uso de acoplamiento molecular o reemplazando directamente otras moléculas pequeñas (por ejemplo, inhibidores) en la estructura cristalina con el sustrato. Las simulaciones MD también requieren la construcción de un campo de fuerza molecular que represente todas las unidades químicas del sistema. Cuando el sistema a simular incluye una molécula pequeña como sustrato, a menudo ocurre que el campo de fuerza molecular estándar proporcionado en el paquete de software MD no cubre la molécula pequeña como sustrato. En este caso, se puede utilizar un software de herramienta que puede generar automáticamente campos de fuerza para moléculas pequeñas. [18-19]. Los archivos de campo de fuerza deben verificarse manualmente y usarse para pruebas de simulación breves antes de usar los campos de fuerza generados automáticamente para simulaciones MD largas.
Fig. 1 Campo de fuerza de mecánica molecular (A) y simulación de dinámica molecular (B)
Fig. 1 Campo de fuerzas de mecánica molecular (A) y simulación de dinámica molecular (B)
1.2
Aplicación a la investigación de enzimas.La información obtenida de las simulaciones MD se puede aplicar de diferentes maneras para guiar las modificaciones de ingeniería enzimática [20].. Por ejemplo, al comparar simulaciones MD a temperatura ambiente y alta temperatura, es posible predecir qué regiones de la molécula de enzima probablemente tendrán la estabilidad estructural más sensible a la temperatura ambiente. La introducción de mutaciones puntuales de prolina, enlaces disulfuro, etc. en estas regiones podría mejorar potencialmente la resistencia al calor de la enzima. Los mutantes se pueden simular en paralelo para evaluar teóricamente si la mutación puede lograr el efecto deseado [27-28]. Además de la temperatura, la MD se puede utilizar para analizar el efecto de los cambios en el pH ambiental, disolventes, etc. sobre la conformación de proteínas y su estabilidad [29-30].
Además de la estabilidad, la MD se ha aplicado para predecir residuos de puntos críticos que tienen el potencial de afectar significativamente la dinámica conformacional asociada con la unión del sustrato/liberación del producto, proporcionando una base para diseñar mutaciones o bibliotecas de mutantes que pueden alterar la selectividad del sustrato, la selectividad de la reacción, la velocidad de liberación del producto, etc. complejos con diferentes (estructuras iniciales) y predicen sustratos o estados estructurales con mayor afinidad (o mayor reactividad). Un método cuantitativo riguroso para calcular la afinidad (o reactividad) son los cálculos de energía libre [33-34]. Debido a la naturaleza computacionalmente intensiva de los cálculos de energía libre, la mayoría de las aplicaciones actuales utilizan métodos cualitativos para la predicción: la discriminación cualitativa de la afinidad relativa puede basarse en la estabilidad de la estructura de los complejos de molécula pequeña-macromolécula, la energía de interacción intermolecular promedio, etc., mientras que La discriminación cualitativa de la reactividad se basa en las distribuciones de configuración geométrica relativa de los grupos funcionales catalíticos y reactivos, etc. [35]. Los resultados de dicha discriminación cualitativa se pueden utilizar como base para diseñar bibliotecas de secuencias evolutivas dirigidas. Además, las simulaciones MD también se pueden utilizar para analizar residuos de puntos críticos alrededor del poro de disociación del producto/unión del sustrato [36-37]. Este tipo de aplicación implica la simulación de vías de disociación para la disociación de moléculas pequeñas de proteínas, y si hay dificultades con escalas de tiempo de simulación insuficientes, se pueden superar utilizando técnicas de muestreo mejoradas [38-39].
2
Modelos de mecánica cuántica (QM) y combinación de mecánica cuántica/mecánica molecular (QM/MM)
2.1
Introducción al método
Para simular los pasos químicos en la catálisis enzimática, como la creación y ruptura de enlaces covalentes, la transferencia de electrones y los saltos entre diferentes estados electrónicos, se requieren modelos de mecánica cuántica (QM). Actualmente, los modelos QM comúnmente utilizados en química computacional se clasifican en varios tipos, como ab initio (ab initio), teoría de densidad funcional (DFT) y métodos semiempíricos [40].. Los métodos semiempíricos son los menos costosos desde el punto de vista computacional. Sin embargo, no son métodos de primeros principios y la confiabilidad de los resultados computacionales depende en gran medida del sistema y problema particular. Tanto el método ab initio como el DFT son métodos de primer principio y son universales. Los modelos DFT prácticos pueden contener más aproximaciones teóricas empíricas que los cálculos ab initio, pero la DFT puede manejar energías de correlación de electrones con una eficiencia computacional muy alta. Además, para muchos problemas de reacciones químicas, los errores computacionales de los mejores modelos DFT para parámetros clave, como los cambios de energía durante el proceso de reacción, ya son tan pequeños como aproximadamente 1 kcal/mol, y los resultados son suficientes para usarse como base para determinar la solidez química de un mecanismo catalítico o vía de reacción en particular.
Dada la configuración geométrica de una molécula, su energía se puede calcular mediante QM. Esto se conoce como cálculo de un solo punto (es decir, trata con un solo punto en el espacio de configuración geométrica). El modelo QM se usa más a menudo para la optimización de geometrías moleculares, es decir, para encontrar una estructura localmente estable (con una energía más baja que las estructuras vecinas) después de cambios sucesivos desde una configuración inicial, o para encontrar los caminos de menor energía que conectan los reactivos con los productos, y los estados de transición a lo largo de los caminos. Estos cálculos requieren un uso intensivo de computación, ya que se deben considerar y comparar diferentes configuraciones geométricas y, por lo general, se deben realizar entre decenas y miles de cálculos de un solo punto.Una estrategia común para ahorrar esfuerzo computacional es optimizar primero una amplia gama de búsquedas de rutas de reacción utilizando modelos QM eficientes con precisión limitada, y luego completar la optimización de la configuración utilizando modelos de mayor precisión cerca de la configuración/ruta de energía más baja buscada, o realizar cálculos de un solo punto.
Actualmente, la aplicación de métodos de gestión de calidad de primer principio a toda la molécula de enzima requiere un uso computacional intensivo, se limita básicamente a cálculos de un solo punto y aún carece de practicidad. El modelo QM/MM (Fig. 2) se usa comúnmente para moléculas grandes [11]. En este modelo, el sistema molecular se divide en al menos dos partes: la parte directamente involucrada en la reacción química se trata con el modelo QM y el resto se trata con mecánica molecular (MM). Existen varias estrategias diferentes para abordar los límites e interacciones QM-MM [41]. En los modelos QM/MM de primeros principios, los cálculos QM son mucho más costosos que los MM. por lo tanto, los métodos de optimización conformacional se usan principalmente para la región QM para predecir o simular su geometría, y las simulaciones de dinámica molecular se pueden usar para muestrear la parte MM [42].. Esto significa que los resultados computacionales pueden ser más sensibles a la estructura inicial de la región QM del sistema. En este caso, se requieren cálculos con diferentes modelos de estructura inicial para obtener resultados confiables. Si se utilizan los métodos semiempíricos [43] o , teorías empíricas de enlaces de valencia [44-45] para la parte QM ,, puede ser posible explorar el espacio conformacional más completamente y reducir el efecto de la estructura inicial mediante muestreo QM/MM MD más largo.
Fig. Modelos 2 Mecánica cuántica (QM)/Molecular Mecánica (MM)
Fig. 2 Modelo de mecánica cuántica (QM)/mecánica molecular (MM).
2.2
Aplicación del método
Tanto el modelo QM [10] como el modelo QM/MM [41] se han utilizado ampliamente para la predicción teórica y las pruebas de los mecanismos químicos de reacciones catalizadas por enzimas. Sus resultados pueden ayudarnos a discernir qué residuos clave participan en el proceso de reacción química, encontrar el paso limitante de la velocidad de la reacción, modelar la estructura de los intermedios de reacción y los estados de transición, analizar cómo interactúan con el entorno enzimático, etc. En comparación con el modelo de grupo QM, el modelo QM/MM puede simular de manera más realista el entorno enzimático en el que se encuentran los centros de reacción química.QM/MM se ha utilizado ampliamente para predecir/probar teóricamente el mecanismo químico de la catálisis enzimática y para analizar y predecir los posibles efectos de los residuos de aminoácidos ambientales en el proceso catalítico [46]. En principio, estos resultados se pueden utilizar para guiar el diseño de bibliotecas de mutaciones de evolución dirigida con el objetivo de mejorar la actividad catalítica y alterar la especificidad o selectividad. Un estudio más desafiante sería obtener enzimas artificiales completamente nuevas basadas en el diseño de nuevos centros activos desde cero a partir de modelos de estructura de estado de transición predichos QM o QM/MM [47].
3
Modelado de medios continuos electrostáticos.
3.1
Principio del método
La catálisis enzimática casi siempre se logra en un entorno de solución específico. Los efectos de los disolventes tienen una influencia crucial sobre las propiedades de las enzimas. Los modelos para calcular los efectos de los tratamientos químicos en los disolventes se dividen en dos categorías: modelos de disolventes explícitos, por ejemplo, en campos de fuerza de mecánica molecular o modelos QM, donde cada molécula de disolvente y cada átomo que contiene se incluye explícitamente en el modelo; y modelos implícitos de disolvente o medio continuo [48], donde las moléculas y átomos del disolvente no están incluidos en el modelo y los llamados «campos medios de disolvente» se utilizan para tratar los efectos del disolvente. que no incluye moléculas ni átomos de disolventes, sino que trata los efectos de los disolventes con el llamado «campo medio de disolventes». La ventaja del modelo de solvente explícito es que es capaz de tratar soluto y solvente de una manera totalmente consistente, modelando de manera realista interacciones específicas como los enlaces de hidrógeno soluto-disolvente, enlaces de sal, etc. La desventaja es que el número de moléculas de disolvente es grande y requiere mucho cálculo. Además, el aumento estocástico del solvente contribuye significativamente a la energía total del sistema, y se debe realizar un promedio de muestra de simulación prolongado para eliminar el efecto del aumento. El modelo de solvente oculto representa el efecto promedio del solvente, y se ha promediado el ascenso y la caída termodinámica del solvente.
Para simplificar el tratamiento, generalmente separamos el efecto del solvente no polar (efecto hidrofóbico) del efecto del solvente polar en el modelo de solvente oculto. La experiencia ha demostrado que la energía libre de solvatación de un soluto no polar es proporcional a su superficie accesible al disolvente (SASA). Por lo tanto, el modelo de solvatación SASA se utiliza a menudo para este componente. Los parámetros de este modelo incluyen los radios atómicos necesarios para calcular el SASA, el radio de la molécula de disolvente (1,4 Å para las moléculas de agua) y una constante de proporcionalidad para la energía libre de solvatación proporcional al SASA.Estos parámetros generalmente se determinan ajustando valores experimentales de la energía libre de solvatación de moléculas pequeñas.
Los modelos más comúnmente utilizados para considerar los efectos de los disolventes polares tratan la región ocupada por el disolvente como un medio continuo con una constante dieléctrica específica (78,4 para el agua), y la región del soluto como ocupada por un medio con una constante dieléctrica baja (comúnmente valorada en 2-8) o un vacío (constante dieléctrica de 1) (Fig. 3A). El medio continuo está polarizado por el campo electrostático generado por la distribución de carga en la región del soluto, y la distribución de carga polarizada resultante a su vez genera un campo electrostático en la región del soluto que actúa sobre la carga del soluto. El campo eléctrico generado por las cargas polarizadas se llama campo de reacción. Por lo tanto, el modelo electrostático de medio continuo también se conoce como modelo de campo de reacción. En el modelo de medio continuo sin iones libres en la región del disolvente, la relación entre el potencial electrostático espacial y la distribución de carga espacial satisface la ecuación de Poisson. Para un entorno de solución que contiene iones libres, la distribución espacial de los iones se ve afectada por el potencial electrostático espacial. Teniendo en cuenta este factor, la relación entre el potencial electrostático espacial y la distribución de carga espacial satisface la ecuación de Poisson-Boltzmann (ecuación PB). La ecuación PB es una ecuación diferencial parcial que trata la relación entre la distribución del potencial electrostático y la distribución de la carga y el dieléctrico en un espacio tridimensional, y se puede resolver numéricamente. El método numérico más común para resolver la ecuación PB para sistemas macromoleculares como las enzimas es el método de diferencias finitas (FD), denominado colectivamente modelo FDPB (Figura 3B) [14]. Con FDPB es posible calcular el potencial electrostático en tres dimensiones basándose en la distribución de carga espacial del soluto, que a su vez permite calcular otras propiedades como la electrostática libre. energía. En los cálculos de QM para sistemas de moléculas pequeñas, el campo de reacción a menudo se reemplaza de manera equivalente por el campo eléctrico generado por la distribución de carga superficial en la superficie molecular, y el modelo correspondiente se denomina modelo de medio continuo polarizable (PCM).
El modelo más comúnmente utilizado para tener en cuenta los efectos del disolvente polar trata la región ocupada por el disolvente como un medio continuo con una constante dieléctrica específica (78,4 para el agua), mientras que la región del soluto se trata como si estuviera ocupada por un medio con una constante dieléctrica baja (comúnmente valorada en 2-8) o un vacío (constante dieléctrica de 1) (Fig. 3A).El medio continuo está polarizado por el campo electrostático generado por la distribución de carga en la región del soluto, y la distribución de carga polarizada resultante a su vez genera un campo electrostático en la región del soluto que actúa sobre la carga del soluto. El campo eléctrico generado por las cargas polarizadas se llama campo de reacción. Por lo tanto, el modelo electrostático de medio continuo también se conoce como modelo de campo de reacción. En el modelo de medio continuo sin iones libres en la región del disolvente, la relación entre el potencial electrostático espacial y la distribución de carga espacial satisface la ecuación de Poisson. Para un entorno de solución que contiene iones libres, la distribución espacial de los iones se ve afectada por el potencial electrostático espacial. Teniendo en cuenta este factor, la relación entre el potencial electrostático espacial y la distribución de carga espacial satisface la ecuación de Poisson-Boltzmann (ecuación PB). La ecuación PB es una ecuación diferencial parcial que trata la relación entre la distribución del potencial electrostático y la distribución de la carga y el dieléctrico en un espacio tridimensional, y se puede resolver numéricamente. El método numérico más común para resolver la ecuación PB para sistemas macromoleculares como las enzimas es el método de diferencias finitas (FD), denominado colectivamente modelo FDPB (Figura 3B) [14]. Con FDPB es posible calcular el potencial electrostático en tres dimensiones basándose en la distribución de carga espacial del soluto, lo que a su vez permite calcular otras propiedades como la electrostática libre. energía. En los cálculos QM de sistemas moleculares pequeños, el campo de reacción a menudo se reemplaza de manera equivalente por el campo eléctrico generado por la distribución de carga superficial en la superficie de la molécula, y el modelo correspondiente se denomina modelo de medio continuo polarizable (PCM).
Fig. 3 Modelo continuo electrostático (A) y método de diferencia finita Poisson-Boltzmann (FDPB) (B)
Fig. 3 Modelo continuo electrostático (A) y método de diferencias finitas Poisson-Boltzmann (FDPB) (B).
3.2
Aplicación del método
Una de las aplicaciones importantes del modelo continuo es estudiar el estado de protonación de grupos de cadenas laterales de aminoácidos cargados en moléculas de enzimas. El software PROPKA predice el pKa de cada grupo disociable resolviendo la ecuación PB para calcular la energía libre electrostática para diferentes estados de protonación [50]. La distribución del potencial electrostático de la superficie de una molécula de enzima es un factor importante que afecta la selectividad del sustrato de la enzima. Dada la estructura espacial y el estado de protonación de una molécula de enzima, la distribución del potencial electrostático de superficie de una molécula de enzima se puede calcular mediante el método FDPB, que también predice el efecto de mutaciones en residuos de aminoácidos o cambios en el pH ambiental, cambios en la concentración iónica, etc., sobre el potencial electrostático de superficie [14].
Al estudiar los pasos químicos de la catálisis enzimática con el modelo de clúster QM, a menudo es necesario utilizar el modelo PCM para simular la influencia electrostática del medio ambiente en la zona de reacción. Si el proceso de reacción implica cambios significativos en la distribución de carga, los resultados de los cálculos de QM en vacío sin el uso de un medio continuo no son razonables e incluso pueden conducir a conclusiones cualitativas erróneas. En el modelo QM/MM, el centro de reacción generalmente está rodeado por moléculas solubles que se tratan de la manera MM y generalmente no hay necesidad de considerar el campo de reacción del medio continuo. Sin embargo, si la carga neta del sistema cambia antes y después de la reacción (por ejemplo, cálculos del potencial redox), es probable que sea necesario tener en cuenta la contribución del entorno de la solución fuera de los límites del sistema a la energía libre de la reacción y, en este caso, los resultados de QM/MM se pueden corregir utilizando el modelo de medio continuo.
Como método que equilibra la eficiencia y la precisión, MM/PBSA se puede utilizar para analizar la afinidad de los complejos proteína-proteína y proteína-molécula pequeña [49]. Para lograr la cancelación de errores, es convencional realizar simulaciones explícitas de dinámica molecular con disolventes de los complejos para obtener una colección de conformaciones; para cada conformación compleja, calcular la energía MM/PBSA del complejo en su conjunto, y de cada monómero que lo compone, respectivamente; y aproximar la energía libre de unión utilizando el promedio de la diferencia entre la energía MM/PBSA del conjunto y la de los monómeros para toda la conformación. Este método se puede utilizar para analizar residuos de puntos críticos que afectan la afinidad del sustrato y también se puede utilizar para predecir cambios en la selectividad del sustrato en mutantes.
4
Otros métodos
4.1
Acoplamiento molecular
El acoplamiento se refiere al proceso computacional de predecir la estructura (y afinidad) de un complejo basado en la estructura de un monómero. El acoplamiento de proteínas y moléculas pequeñas es una herramienta central para la detección virtual de fármacos basada en estructuras, para la cual se han desarrollado varios algoritmos [13]. Estos algoritmos y modelos también se pueden aplicar al acoplamiento de complejos sustrato-enzima. La detección virtual de fármacos requiere la consideración de una gran cantidad de moléculas pequeñas diferentes y, por razones de eficiencia computacional, los cambios estructurales del receptor (o simplemente de la cadena lateral) a menudo no se tienen en cuenta en los cálculos de acoplamiento molecular. A diferencia del cribado virtual, en los estudios de acoplamiento sustrato-enzima a menudo sólo se tienen en cuenta uno o varios sustratos diferentes y, en principio, se pueden tener más en cuenta los cambios estructurales en la enzima. La forma más sencilla de lograr esto es obtener diversas estructuras enzimáticas mediante métodos de muestreo conformacional como MD, que se acoplan por separado al sustrato. En el acoplamiento sustrato-enzima, a menudo también es posible utilizar la disposición espacial relativa del sustrato y los grupos funcionales catalíticos para seleccionar/evaluar los resultados del acoplamiento.
4.2
Predicción de poros de moléculas pequeñas basada en la geometría.
Numerosos estudios experimentales han revelado que algunas mutaciones alejadas del centro activo pueden tener un gran impacto en el rendimiento catalítico de las enzimas. Algunos de estos sitios pueden actuar alterando el poro de unión del sustrato/liberación del producto, y el tamaño del poro, las propiedades fisicoquímicas de los residuos alrededor del poro, etc. pueden cambiar la velocidad de paso del sustrato/producto y afectar la selectividad del sustrato. Se pueden utilizar métodos de predicción de poros para encontrar residuos calientes relevantes y proporcionar una base para el diseño de bibliotecas de evolución dirigida. Hay varios métodos basados en estructuras geométricas disponibles para predecir picaduras en la superficie de proteínas, cavidades internas, poros que conectan diferentes regiones, etc. [51-53]. Estos métodos utilizan estructuras espaciales estáticas como entradas y, en su mayoría, emplean métodos geométricos y teóricos de gráficos para realizar la predicción con alta eficiencia computacional.
4.3
Métodos de comparación de centros activos
Actualmente, se ha acumulado una gran cantidad de datos de estructuras 3D de enzimas con diferentes tipos y familias de estructuras en la base de datos de estructuras 3D de proteínas (PDB). Si comparamos diferentes enzimas, encontraremos que algunas de ellas tienen un alto grado de similitud en los centros activos (ejemplos típicos son los centros activos de la tríada catalítica compartidos por las serina proteasas), aunque las secuencias estructurales generales no son similares. El método de comparación de la estructura del centro activo [54-55] se puede utilizar para recuperar automáticamente los centros activos de otras enzimas que son similares al centro activo de la enzima actual.Apilar múltiples centros activos similares en un espacio tridimensional y analizar las similitudes y diferencias entre diferentes centros activos puede proporcionar información valiosa para la selección del sitio de mutación.
5
Resumen
En aras de la claridad de la presentación, nuestra introducción de los métodos anteriores se clasifica. En la práctica, los diferentes tipos de métodos no son mutuamente excluyentes. Se pueden utilizar combinados de muchas maneras para responder mejor a nuestras preguntas de interés. Por ejemplo, en simulaciones de complejos enzima-sustrato, se puede utilizar el acoplamiento molecular para obtener la conformación inicial de la simulación; el conjunto de conformaciones obtenidas a partir de simulaciones MD se puede utilizar para análisis de predicción de poros, acoplamiento molecular, simulaciones QM/MM, etc.; Los modelos MM que inscriben los estados de transición obtenidos de los modelos QM o QM/MM se pueden construir y utilizar durante simulaciones MD clásicas a largo plazo para analizar los efectos del aumento y caída conformacionales en los procesos químicos, o para simular una gran cantidad de mutantes para realizar una detección virtual de mutantes basada en simulaciones MD; el enfoque MM/PBSA, que ya hemos mencionado, es una combinación de MD y modelado de medio continuo, y así sucesivamente.
El estudio de sistemas de biomoléculas como las proteínas mediante métodos de química computacional tiene una historia de más de 40 años. Estos métodos se han utilizado cada vez más ampliamente en la investigación de enzimas industriales y se han desarrollado continuamente. Los equipos de investigación de China tanto en química computacional como en ingeniería de enzimas industriales se están expandiendo y sus capacidades de investigación están mejorando rápidamente. La aplicación de la química computacional en la ingeniería enzimática se ampliará y profundizará a medida que la combinación cruzada de estas dos disciplinas se vuelva cada vez más estrecha. La ingeniería de proteínas, la evolución dirigida y otras técnicas han tenido un gran impacto en la investigación de enzimas industriales. Se espera que el futuro desarrollo de métodos computacionales, especialmente el avance de nuevos métodos de diseño de enzimas, traiga nuevos avances tecnológicos para la investigación de enzimas industriales en la era de la biología sintética.
Cómo suelen evaluar los compradores las enzimas y los ingredientes de procesamiento de alimentos
En proyectos de procesamiento de alimentos y enzimas, el marco de decisión más útil suele ser el ajuste de la aplicación más la estabilidad del proceso: qué ingrediente funciona bajo las condiciones de pH, temperatura, tiempo y sustrato previstas sin crear un problema de cumplimiento o calidad posterior.
- Defina primero el objetivo de procesamiento: Las aplicaciones de sabor, hidrólisis, textura, fermentación, limpieza y bioprocesos a menudo necesitan perfiles de actividad muy diferentes.
- Compruebe la ventana de funcionamiento real: El pH, la temperatura, el tiempo de residencia y el tipo de sustrato a menudo importan más que la afirmación principal del producto.
- Revisar la consistencia y el impacto posterior:La dosis, la influencia sensorial, la filtración y el comportamiento de vida útil de pueden afectar el valor comercial final.
- Use validación piloto:Las pruebas de producción pequeñas de generalmente revelan las diferencias más útiles en actividad, eficiencia y ajuste del proceso.
Referencias de productos recomendados
- CHLUMICRYL HEMA: Una conocida referencia de monómero polar en sistemas basados en adhesión y reactividad.
- Longzyme Lipasa: Una referencia directa del producto para discusiones sobre alimentos, limpieza o bioprocesos relacionados con la lipasa.
- Longzyme Beta-Amylase: Una referencia práctica de enzimas cuando se están revisando la conversión del almidón y la actividad de procesamiento de alimentos.
- Glucoamilasa compuesta de longzima: Una referencia enzimática útil cuando la sacarificación o el rendimiento del procesamiento relacionado son importantes.
Preguntas frecuentes para compradores y formuladores
¿Por qué una enzima de alta actividad no es automáticamente la mejor opción comercial?
Porque la mejor enzima es la que funciona de manera confiable en las condiciones reales del proceso y proporciona el resultado final deseado sin crear nuevos problemas.
¿Deben seleccionarse los ingredientes alimentarios y biotecnológicos únicamente a partir de hojas de datos?
Por lo general, es más seguro combinar la revisión de especificaciones con una prueba piloto o de aplicación porque los sustratos reales y las ventanas de proceso pueden cambiar mucho el resultado.
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| Glucoamilasa compuesta | 9032-08-0 |
| Pullulanasa | 9075-68-7 |
| Xilanasa | 37278-89-0 |
| Celulasa | 9012-54-8 |
| Naringinasa | 9068-31-9 |
| β-amilasa | 9000-91-3 |
| Glucosa oxidasa | 9001-37-0 |
| alfa-amilasa | 9000-90-2 |
| Pectinasa | 9032-75-1 |
| Peroxidasa | 9003-99-0 |
| Lipasa | 9001-62-1 |
| Catalase | 9001-05-2 |
| TANNASE | 9025-71-2 |
| Elastase | 39445-21-1 |
| Urease | 9002-13-5 |
| DEXTRANASE | 9025-70-1 |
| L-Láctica deshidrogenasa | 9001-60-9 |
| Malato de deshidrogenasa | 9001-64-3 |
| Colesterol oxidasa | 9028-76-6 |