¿Cuál es el enfoque de la química computacional en la investigación enzimática industrial?

El documento presenta los principales métodos de química computacional utilizados en la investigación industrial de enzimas, especialmente para guiar la ingeniería enzimática, incluyendo el campo de fuerza de la mecánica molecular y las simulaciones de dinámica molecular, la mecánica cuántica y la modelización combinada de mecánica cuántica/mecánica molecular, la modelización electrostática continua y el acoplamiento molecular. Estos métodos se resumen en el texto desde dos perspectivas, respectivamente: en primer lugar, los conceptos básicos de los propios métodos, los resultados de los cálculos originales, las condiciones de aplicabilidad y las ventajas y desventajas; y en segundo lugar, la valiosa información obtenida de los cálculos para guiar el diseño de mutantes y bibliotecas de mutantes.

La aplicación industrial de las enzimas tiene una historia centenaria, y la catálisis enzimática se utiliza ampliamente en diferentes industrias como la alimentaria, la agrícola, la médica y la química debido a su alta eficiencia, alta especificidad y selectividad, y respeto al medio ambiente [1-2]. Dado que el entorno de aplicación industrial es muy diferente del entorno en el que viven las enzimas en la naturaleza, la naturaleza y la función catalítica de las enzimas naturales y su entorno de aplicación no suelen coincidir o no son óptimas. En este caso, es necesario modificar la secuencia natural de aminoácidos de la enzima con la ayuda de la ingeniería enzimática para mejorar su rendimiento [3]. La estrategia de ingeniería enzimática más utilizada es la construcción de bibliotecas de mutaciones para el cribado, es decir, la evolución dirigida en laboratorio [4]. Uno de los requisitos previos necesarios para una evolución dirigida eficaz es que la capacidad de la biblioteca (es decir, el número de mutantes contenidos en la biblioteca) de la biblioteca mutante sometida a cribado sea suficientemente grande en relación con la proporción de mutantes potencialmente beneficiosos en la biblioteca. El tamaño de una biblioteca mutante suele estar limitado por el método de cribado, los recursos disponibles y otras condiciones objetivas. La cuestión clave es cómo aumentar el porcentaje de mutantes efectivos en la biblioteca de mutantes. La comprensión profunda de la relación entre la secuencia enzimática, la estructura y las propiedades importantes puede ayudar a identificar los puntos críticos de mutación, limitar el alcance de la mutación y lograr un diseño de calidad de la biblioteca de mutantes. Los métodos de química computacional son un medio importante para obtener esta comprensión. Se ha demostrado que las bibliotecas de mutaciones de proteínas diseñadas computacionalmente pueden aumentar el porcentaje de mutantes efectivos en varios órdenes de magnitud en relación con las bibliotecas de mutaciones aleatorias [5]. Para algunos temas difíciles de ingeniería enzimática o de proteínas, la mejora sustancial que puede aportar la computación puede ser suficiente para determinar el éxito o el fracaso final del tema, que ya no se limita a la mejora de la eficiencia. De hecho, los métodos de química computacional y biología computacional han permitido diseñar con éxito enzimas artificiales desde cero con funciones catalíticas que las enzimas naturales no poseen. Dado que otros análisis de este álbum se han dedicado a métodos para el diseño óptimo automatizado de secuencias de aminoácidos, este artículo se centrará en métodos computacionales para simular y analizar enzimas con una secuencia de aminoácidos determinada. Por supuesto, los investigadores pueden utilizar estos métodos para estudiar el tipo salvaje y los mutantes por separado y luego comparar los resultados.
El estudio de las proteínas, especialmente de las enzimas, ha sido durante mucho tiempo una importante frontera de la investigación en química computacional [6-8]. Los principales métodos incluyen simulaciones de dinámica molecular (MD clásica) basadas en campos de fuerza de mecánica molecular clásica [9], mecánica cuántica (QM) [10] y métodos combinados de mecánica cuántica/mecánica molecular (QM/MM) [8,11-12], predicción de complejos intermoleculares, es decir, acoplamiento molecular (Docking) [13], y modelo de continuo polarizable (PCM) para cuantificar los efectos electrostáticos y de los disolventes [14]. ) como el modelo de Poisson-Boltzmann (PB) [14], y algunos modelos basados en propiedades geométricas. En este artículo, ofreceremos una visión general de cada uno de estos métodos desde dos perspectivas: en primer lugar, sobre los propios métodos, incluidos los principios básicos, los resultados computacionales originales, las condiciones de aplicabilidad y las ventajas y desventajas (potenciales), etc.; y en segundo lugar, sobre cómo utilizar estos métodos para obtener información relevante para la ingeniería, como una comprensión más profunda de los mecanismos relevantes para la catálisis, predicciones teóricas o explicaciones de cambios en las propiedades o funciones de diferentes mutantes con respecto al tipo silvestre, que pueden guiar el diseño de bibliotecas de mutaciones de alta calidad para la evolución dirigida, o el diseño de bibliotecas de mutaciones de alta calidad, o el diseño de bancos de mutaciones. diseño de bibliotecas de mutaciones de alta calidad, o sugerir sitios de mutación específicos y tipos de mutación basados en el análisis de resultados computacionales en bruto, etc.

1

Simulación de dinámica molecular (MD) basada en campos de fuerza de mecánica molecular clásica (MM)

1.1

Introducción al método

Por el momento, no consideramos los cambios químicos involucrados en la catálisis enzimática, sino solo los procesos de cambios conformacionales enzimáticos, formación y disociación de complejos no covalentes entre la enzima y los reactivos (o productos) debido al movimiento térmico molecular. Durante estos procesos, el estado electrónico de la molécula no cambia (por ejemplo, no se rompen ni se crean enlaces covalentes), y se aplica el modelo del campo de fuerza de la mecánica molecular. El llamado campo de fuerza de la mecánica molecular es una función matemática empírica que expresa la dependencia de la energía potencial de un sistema molecular de la configuración geométrica (es decir, las coordenadas espaciales de todos los átomos que componen el sistema molecular) (Fig. 1A). En otras palabras, si utilizamos X para representar las coordenadas espaciales de todos los átomos y VMM (X) para representar la energía potencial del campo de fuerza molecular, la energía potencial cambia a medida que la molécula cambia de una conformación X1 a otra X2:
∆VMM = VMM (X2) – VMM (X1).
Según la teoría termodinámica, los átomos de una molécula están siempre en movimiento térmico, es decir, X cambia constantemente con el tiempo; además, cuando hacemos observaciones experimentales, la muestra siempre consta de un gran número de moléculas (a excepción de los experimentos con una sola molécula), con moléculas diferentes en diferentes estados conformacionales. Por lo tanto, desde un punto de vista cinético, debemos considerar los cambios conformacionales a lo largo del tiempo, y desde un punto de vista termodinámico, debemos considerar la distribución de probabilidad de moléculas con diferentes conformaciones. La simulación de dinámica molecular (MD) es el modelo más sencillo para examinar estos dos aspectos de las propiedades (Fig. 1B). En la simulación MD, partimos de una conformación inicial, calculamos la fuerza que actúa sobre cada átomo en cada punto temporal basándonos en la conformación actual y la función de energía potencial (la fuerza es la derivada negativa de la función de energía potencial con respecto a las coordenadas de los átomos), integramos numéricamente las ecuaciones de movimiento de Newton para obtener la conformación en el siguiente punto temporal, y repetimos el proceso para obtener la trayectoria de la evolución de la conformación a lo largo del tiempo.
Entre medias, se pueden utilizar algoritmos especiales para simular el efecto de los factores ambientales (por ejemplo, temperatura, presión, etc.) en el movimiento molecular. Según el principio termodinámico, cuando el intervalo de tiempo es lo suficientemente largo, la distribución de probabilidad de la conformación de la misma molécula en diferentes puntos temporales y la conformación de diferentes moléculas en el estado de equilibrio termodinámico son las mismas (es decir, el promedio de tiempo es equivalente al promedio del sistema). Por lo tanto, si la simulación MD se realiza durante un período de tiempo suficientemente largo, el conjunto de conformaciones obtenidas de la simulación puede utilizarse como muestra de la distribución de conformaciones moleculares en un estado de equilibrio termodinámico particular. Basándonos en este principio, podemos analizar propiedades observables arbitrarias de un sistema en su estado de equilibrio termodinámico basándonos en las trayectorias temporales obtenidas por MD.
La MD proporciona una poderosa herramienta computacional para analizar exhaustivamente el proceso de cambio cinético de los cambios conformacionales y las importantes distribuciones termodinámicas cuánticas microscópicas a resolución atómica, lo cual es particularmente importante para dilucidar los principios de diseño y los mecanismos de funcionamiento de máquinas biomacromoleculares complejas como las enzimas. Dado que los métodos experimentales actuales para el análisis de estructuras macromoleculares solo pueden proporcionar estructuras estáticas promediadas espacio-temporalmente, las simulaciones MD tienen una función insustituible en la investigación relacionada. Bajo esta premisa, la propia herramienta de MD sigue en proceso de mejora y perfeccionamiento continuos. Metodológicamente, las principales limitaciones de la MD provienen de dos aspectos: primero, la precisión del modelo de campo de fuerza molecular; y segundo, el tiempo limitado de simulación dificulta la realización del muestreo completo del espacio conformacional. En cuanto al primer problema, el campo de fuerza molecular ha mejorado mucho en los últimos años, y la precisión de la descripción termodinámica del equilibrio conformacional de las macromoléculas biológicas, especialmente los sistemas proteicos, ha aumentado, simulando con éxito una variedad de moléculas proteicas desde el proceso de plegamiento de la cabeza hasta la estructura natural [15-16]. En términos de tiempo de simulación, debido al desarrollo de hardware y software informáticos, ahora es posible realizar simulaciones del orden de microsegundos para sistemas de tamaño habitual (por ejemplo, moléculas enzimáticas de cientos de residuos en solución acuosa) utilizando hardware informático convencional (por ejemplo, servidores multinúcleo utilizados por el grupo). A esta escala de tiempo, se pueden observar procesos como la apertura y el cierre de dominios estructurales o regiones anulares. Si se dispone de más recursos computacionales, también se pueden realizar simulaciones directas de procesos como la unión/disociación de sustratos. Para estudiar procesos en escalas temporales más allá del alcance de la simulación (por ejemplo, cambios funcionales a gran escala de proteínas alostéricas, etc.), se pueden utilizar métodos de muestreo mejorados [17], siempre que el usuario tenga un conocimiento más profundo de la teoría de la MD.
En la actualidad, la mayoría de las aplicaciones de simulación MD cubren escalas de tiempo que van desde nanosegundos a microsegundos, y el muestreo del espacio conformacional se limita principalmente a la proximidad de la estructura inicial (para las proteínas de dominio único, suele ser el aumento y la caída estructural del desplazamiento de la media cuadrática (RMS) en el rango de 3-4 Å). Por lo tanto, es necesario utilizar una estructura inicial razonable como entrada para el MD para que los resultados de la simulación sean significativos. En la mayoría de los casos, se utilizan como estructuras iniciales para MD estructuras cristalinas determinadas experimentalmente o estructuras basadas en modelos comparativos de proteínas homólogas. Al simular complejos enzima-sustrato, a menudo es necesario modelar la estructura inicial del complejo basándose en la estructura de la enzima vacía o de la enzima en complejo con otras moléculas, ya sea mediante el acoplamiento molecular o sustituyendo directamente otras moléculas pequeñas (por ejemplo, inhibidores) en la estructura cristalina por el sustrato. Las simulaciones de dinámica molecular también requieren la construcción de un campo de fuerza molecular que represente todas las unidades químicas del sistema. Cuando el sistema que se va a simular incluye una molécula pequeña como sustrato, suele ocurrir que el campo de fuerza molecular estándar proporcionado en el paquete de software de dinámica molecular no cubre la molécula pequeña como sustrato. En este caso, se puede utilizar un software de herramientas que pueda generar automáticamente campos de fuerza para moléculas pequeñas [18-19]. Los archivos de campo de fuerza deben comprobarse manualmente y utilizarse para ensayos de simulación cortos antes de utilizar los campos de fuerza generados automáticamente para simulaciones de MD largas.

Fig. 1 Campo de fuerza de mecánica molecular (A) y simulación de dinámica molecular (B)
Fig. 1 Campo de fuerza de mecánica molecular (A) y simulación de dinámica molecular (B)

1.2

Aplicación a la investigación de enzimas

La información obtenida de las simulaciones MD puede aplicarse de diferentes maneras para guiar las modificaciones de la ingeniería enzimática [20]. Por ejemplo, comparando simulaciones MD a temperatura ambiente y a alta temperatura, es posible predecir qué regiones de la molécula enzimática son susceptibles de tener la estabilidad estructural más sensible a la temperatura ambiente. La introducción de mutaciones puntuales de prolina, enlaces disulfuro, etc. en estas regiones podría mejorar la resistencia al calor de la enzima [21-24]. Otra estrategia para mejorar la estabilidad es diseñar mutantes que formen más enlaces de hidrógeno y sal en la superficie [25-26]. Antes de validar experimentalmente tales mutantes, se pueden simular en paralelo el tipo salvaje y los mutantes para evaluar teóricamente si la mutación puede lograr el efecto deseado [27-28]. Además de la temperatura, la MD puede utilizarse para analizar el efecto de los cambios en el pH ambiental, los disolventes, etc. en la conformación de las proteínas y su estabilidad [29-30].
Además de la estabilidad, la MD se ha aplicado para predecir residuos de puntos calientes que tienen el potencial de afectar significativamente a la dinámica conformacional asociada a la unión del sustrato/liberación del producto, proporcionando una base para diseñar mutaciones o bibliotecas mutantes que pueden alterar la selectividad del sustrato, la selectividad de la reacción, la tasa de liberación del producto, etc. [31-32]. Una de las formas de estudiar la selectividad del sustrato/reacción con MD es comparar los resultados de la simulación de complejos enzima-sustrato con diferentes (estructuras iniciales) y predecir sustratos o estados estructurales con mayor afinidad (o mayor reactividad). Un método cuantitativo riguroso para calcular la afinidad (o reactividad) son los cálculos de energía libre [33-34]. Debido a la naturaleza computacionalmente intensiva de los cálculos de energía libre, la mayoría de las aplicaciones actuales utilizan métodos cualitativos para la predicción: la discriminación cualitativa de la afinidad relativa puede basarse en la estabilidad de la estructura de los complejos de moléculas pequeñas y macromoléculas, la energía media de interacción intermolecular, etc., mientras que la discriminación cualitativa de la reactividad se basa en las distribuciones relativas de la configuración geométrica de los grupos funcionales catalíticos y reactivos, etc. [35]. Los resultados de dicha discriminación cualitativa pueden utilizarse como base para diseñar bibliotecas de secuencias evolutivas dirigidas. Además, las simulaciones de dinámica molecular también pueden utilizarse para analizar los residuos de puntos calientes alrededor del poro de unión del sustrato/disociación del producto [36-37]. Este tipo de aplicación implica la simulación de las vías de disociación de pequeñas moléculas de las proteínas y, si hay dificultades con escalas de tiempo de simulación insuficientes, estas pueden superarse utilizando técnicas de muestreo mejoradas [38-39].

2

Modelos de mecánica cuántica (QM) y de mecánica cuántica/mecánica molecular combinadas (QM/MM)

2.1

Introducción al método

Para simular los pasos químicos en la catálisis enzimática, como la creación y ruptura de enlaces covalentes, la transferencia de electrones y los saltos entre diferentes estados electrónicos, se requieren modelos de mecánica cuántica (QM). En la actualidad, los modelos de QM comúnmente utilizados en química computacional se clasifican en varios tipos, como ab initio (ab initio), teoría del funcional de la densidad (DFT) y métodos semiempíricos [40]. Entre ellos, los métodos semiempiricos son los menos costosos computacionalmente. Sin embargo, no son métodos de primeros principios y la fiabilidad de los resultados computacionales depende en gran medida del sistema y del problema en particular. Tanto los métodos ab initio como los DFT son métodos de primeros principios y son universales. Los modelos DFT prácticos pueden contener más aproximaciones teóricas empíricas que los cálculos ab initio, pero la DFT puede manejar energías de correlación de electrones con una eficiencia computacional muy alta. Además, para muchos problemas de reacciones químicas, los errores computacionales de los mejores modelos DFT para parámetros clave como los cambios de energía durante el proceso de reacción ya son tan pequeños como aproximadamente 1 kcal/mol, y los resultados son suficientes para utilizarlos como base para determinar la solidez química de un mecanismo catalítico o vía de reacción en particular.
Dada la configuración geométrica de una molécula, su energía puede calcularse utilizando QM. Esto se conoce como cálculo de un solo punto (es decir, se trata de un solo punto en el espacio de configuración geométrica). El modelo QM se utiliza con mayor frecuencia para la optimización de geometrías moleculares, es decir, para encontrar una estructura localmente estable (con una energía más baja que las estructuras vecinas) después de cambios sucesivos a partir de una configuración inicial, o para encontrar las rutas de menor energía que conectan los reactivos con los productos, y los estados de transición a lo largo de las rutas. Estos cálculos son computacionalmente intensivos, ya que hay que considerar y comparar diferentes configuraciones geométricas, y normalmente hay que realizar de decenas a miles de cálculos de un solo punto. Una estrategia común para ahorrar esfuerzo computacional es optimizar primero una amplia gama de búsquedas de rutas de reacción utilizando modelos de QM eficientes con una precisión limitada, y luego completar la optimización de la configuración utilizando modelos de mayor precisión cerca de la configuración/ruta de energía más baja buscada, o realizar cálculos de un solo punto.
Actualmente, la aplicación de métodos de QM de primeros principios a toda la molécula enzimática requiere un gran esfuerzo computacional, se limita básicamente a cálculos de un solo punto y aún carece de practicidad. El modelo QM/MM (Fig. 2) se utiliza comúnmente para moléculas grandes [11]. En este modelo, el sistema molecular se divide en al menos dos partes: la parte directamente involucrada en la reacción química se trata con el modelo QM, y el resto se trata con mecánica molecular (MM). Existen varias estrategias diferentes para tratar los límites e interacciones entre la QM y la MM [41]. En los modelos QM/MM de primeros principios, los cálculos QM son mucho más costosos que los MM. Por lo tanto, los métodos de optimización conformacional se utilizan principalmente para la región QM para predecir o simular su geometría, y las simulaciones de dinámica molecular pueden utilizarse para muestrear la parte MM [42]. Esto significa que los resultados computacionales pueden ser más sensibles a la estructura inicial de la región QM del sistema. En este caso, se requieren cálculos con diferentes modelos de estructura inicial para obtener resultados fiables. Si se utilizan métodos semiempiricos [43] o teorías empíricas de enlace de valencia [44-45] para la parte QM, puede ser posible explorar el espacio conformacional más completamente y reducir el efecto de la estructura inicial mediante un muestreo MD QM/MM más largo.

Fig. 2 Modelos de mecánica cuántica (QM)/mecánica molecular (MM)
Fig. 2 Modelo de mecánica cuántica (QM)/mecánica molecular (MM).

2.2

Aplicación del método

Tanto el modelo QM [10] como el modelo QM/MM [41] se han utilizado ampliamente para la predicción teórica y el ensayo de los mecanismos químicos de las reacciones catalizadas por enzimas. Sus resultados pueden ayudarnos a discernir qué residuos clave participan en el proceso de reacción química, encontrar el paso limitante de la reacción, modelar la estructura de los intermedios de reacción y los estados de transición, analizar cómo interactúan con el entorno enzimático, etc. En comparación con el modelo de clúster QM, el modelo QM/MM puede simular de forma más realista el entorno enzimático en el que se encuentran los centros de reacción química. El QM/MM se ha utilizado ampliamente para predecir/probar teóricamente el mecanismo químico de la catálisis enzimática y para analizar y predecir los posibles efectos de los residuos de aminoácidos ambientales en el proceso catalítico [46]. En principio, estos resultados pueden utilizarse para guiar el diseño de bibliotecas de mutaciones de evolución dirigida con el objetivo de mejorar la actividad catalítica y alterar la especificidad o selectividad. Un estudio más desafiante sería obtener enzimas artificiales completamente nuevas basadas en el diseño de nuevos centros activos desde cero a partir de modelos de estructura de estado de transición predichos por QM o QM/MM [47].

3

Modelado de medios continuos electrostáticos

3.1

Principio del método

La catálisis enzimática casi siempre se lleva a cabo en un entorno de solución específico. Los efectos del disolvente tienen una influencia crucial en las propiedades de la enzima. Los modelos para calcular los efectos de los disolventes en los tratamientos químicos se dividen en dos categorías: modelos de disolventes explícitos, por ejemplo, en campos de fuerza de mecánica molecular o modelos QM, donde cada molécula de disolvente y cada átomo en ella se incluye explícitamente en el modelo; y modelos de disolventes implícitos o medios continuos [48], donde las moléculas y los átomos de disolvente no se incluyen en el modelo y se utilizan los llamados «campos medios de disolvente» para tratar los efectos del disolvente. que no incluye moléculas y átomos de disolvente, pero trata los efectos del disolvente con el llamado «campo medio del disolvente». La ventaja del modelo de disolvente explícito es que puede tratar el soluto y el disolvente de una manera totalmente coherente, modelando de forma realista interacciones específicas como el enlace de hidrógeno soluto-disolvente, el enlace salino, etc. La desventaja es que el número de moléculas de disolvente es grande y computacionalmente intensivo. Además, el aumento estocástico del disolvente contribuye significativamente a la energía total del sistema, y se debe realizar un largo promedio de muestras de simulación para eliminar el efecto del aumento. El modelo de disolvente oculto representa el efecto promedio del disolvente, y se ha promediado el aumento y la caída termodinámicos del disolvente.
Para simplificar el tratamiento, solemos separar el efecto del disolvente no polar (efecto hidrofóbico) del efecto del disolvente polar en el modelo de disolvente oculto. La experiencia ha demostrado que la energía libre de solvatación de un soluto no polar es proporcional a su superficie de área accesible al disolvente (SASA). Por lo tanto, el modelo de solvatación SASA se utiliza a menudo para este componente. Los parámetros de este modelo incluyen los radios atómicos necesarios para calcular el SASA, el radio de la molécula de disolvente (1,4 Å para las moléculas de agua) y una constante de proporcionalidad para la energía libre de solvatación proporcional al SASA. Estos parámetros se determinan generalmente ajustando los valores experimentales de la energía libre de solvatación de moléculas pequeñas.
Los modelos más utilizados para considerar los efectos de los disolventes polares tratan la región ocupada por el disolvente como un medio continuo con una constante dieléctrica específica (78,4 para el agua), y la región del soluto como ocupada por un medio con una constante dieléctrica baja (comúnmente valorada entre 2 y 8) o un vacío (constante dieléctrica de 1) (Fig. 3A). El medio continuo se polariza por el campo electrostático generado por la distribución de carga en la región del soluto, y la distribución de carga polarizada resultante genera a su vez un campo electrostático en la región del soluto que actúa sobre la carga del soluto. El campo eléctrico generado por las cargas polarizadas se denomina campo de reacción. Por lo tanto, el modelo de medio continuo electrostático también se conoce como modelo de campo de reacción. En el modelo de medio continuo sin iones libres en la región del soluto, la relación entre el potencial electrostático espacial y la distribución de la carga espacial satisface la ecuación de Poisson. Para un entorno de solución que contenga iones libres, la distribución espacial de los iones se ve afectada por el potencial electrostático espacial. Teniendo en cuenta este factor, la relación entre el potencial electrostático espacial y la distribución espacial de la carga satisface la ecuación de Poisson-Boltzmann (ecuación PB). La ecuación PB es una ecuación diferencial parcial relativa a la relación entre la distribución del potencial electrostático y la distribución de la carga y el dieléctrico en un espacio tridimensional, y puede resolverse numéricamente. El método numérico más común para resolver la ecuación de PB para sistemas macromoleculares como las enzimas es el método de diferencias finitas (FD), conocido colectivamente como modelo FDPB (Figura 3B) [14]. Con el modelo FDPB es posible calcular el potencial electrostático en tres dimensiones basándose en la distribución de la carga espacial del soluto, lo que a su vez permite calcular otras propiedades como la energía libre electrostática. En los cálculos QM para sistemas de moléculas pequeñas, el campo de reacción se sustituye a menudo de forma equivalente por el campo eléctrico generado por la distribución de la carga superficial en la superficie molecular, y el modelo correspondiente se denomina modelo de medio continuo polarizable (PCM).
El modelo más utilizado para explicar los efectos de los disolventes polares trata la región ocupada por el disolvente como un medio continuo con una constante dieléctrica específica (78,4 para el agua), mientras que la región del soluto se trata como si estuviera ocupada por un medio con una constante dieléctrica baja (comúnmente valorada entre 2 y 8) o un vacío (constante dieléctrica de 1) (Fig. 3A). El medio continuo se polariza por el campo electrostático generado por la distribución de carga en la región del soluto, y la distribución de carga polarizada resultante genera a su vez un campo electrostático en la región del soluto que actúa sobre la carga del soluto. El campo eléctrico generado por las cargas polarizadas se denomina campo de reacción. Por lo tanto, el modelo de medio continuo electrostático también se conoce como modelo de campo de reacción. En el modelo de medio continuo sin iones libres en la región del soluto, la relación entre el potencial electrostático espacial y la distribución de la carga espacial satisface la ecuación de Poisson. Para un entorno de solución que contenga iones libres, la distribución espacial de los iones se ve afectada por el potencial electrostático espacial. Teniendo en cuenta este factor, la relación entre el potencial electrostático espacial y la distribución espacial de la carga satisface la ecuación de Poisson-Boltzmann (ecuación PB). La ecuación PB es una ecuación diferencial parcial relativa a la relación entre la distribución del potencial electrostático y la distribución de la carga y el dieléctrico en un espacio tridimensional, y puede resolverse numéricamente. El método numérico más común para resolver la ecuación de Poisson-Boltzmann para sistemas macromoleculares como las enzimas es el método de diferencias finitas (FD), conocido colectivamente como modelo FDPB (Figura 3B) [14]. Con el método FDPB es posible calcular el potencial electrostático en tres dimensiones basándose en la distribución de la carga espacial del soluto, lo que a su vez permite calcular otras propiedades como la energía libre electrostática. En los cálculos QM de sistemas moleculares pequeños, el campo de reacción se sustituye a menudo de forma equivalente por el campo eléctrico generado por la distribución de la carga superficial en la superficie de la molécula, y el modelo correspondiente se denomina modelo de medio continuo polarizable (PCM).

Fig. 3 Modelo electrostático continuo (A) y método de las diferencias finitas de Poisson-Boltzmann (FDPB) (B)
Fig. 3 Modelo electrostático continuo (A) y método de las diferencias finitas de Poisson-Boltzmann (FDPB) (B).

3.2

Aplicación del método

Una de las aplicaciones importantes del modelo de continuo es estudiar el estado de protonación de los grupos de cadenas laterales de aminoácidos cargados en las moléculas de enzimas. El software PROPKA predice el pKa de cada grupo disociable resolviendo la ecuación de PB para calcular la energía libre electrostática para diferentes estados de protonación [50]. La distribución del potencial electrostático superficial de una molécula de enzima es un factor importante que afecta a la selectividad del sustrato de la enzima. Dada la estructura espacial y el estado de protonación de una molécula enzimática, la distribución del potencial electrostático superficial de una molécula enzimática puede calcularse mediante el método FDPB, que también predice el efecto de las mutaciones en los residuos de aminoácidos o los cambios en el pH ambiental, los cambios en la concentración iónica, etc., sobre el potencial electrostático superficial [14].
Al estudiar los pasos químicos de la catálisis enzimática con el modelo de clúster QM, a menudo es necesario utilizar el modelo PCM para simular la influencia electrostática del entorno en la zona de reacción. Si el proceso de reacción implica cambios significativos en la distribución de cargas, los resultados de los cálculos QM de vacío sin el uso de un medio continuo no son razonables e incluso pueden conducir a conclusiones cualitativas erróneas. En el modelo QM/MM, el centro de reacción suele estar rodeado de moléculas solubles que se tratan de manera MM, y generalmente no es necesario considerar el campo de reacción del medio continuo. Sin embargo, si la carga neta del sistema cambia antes y después de la reacción (por ejemplo, cálculos de potencial redox), es probable que deba tenerse en cuenta la contribución del entorno de la solución fuera del límite del sistema a la energía libre de la reacción, y en este caso los resultados de QM/MM pueden corregirse utilizando el modelo de medio continuo.
Como método que equilibra la eficiencia y la precisión, MM/PBSA puede utilizarse para analizar la afinidad de los complejos proteína-proteína y proteína-molécula pequeña [49]. Para lograr la cancelación de errores, es habitual realizar simulaciones de dinámica molecular de disolventes explícitos de los complejos para obtener una colección de conformaciones; para cada conformación del complejo, calcular la energía MM/PBSA del complejo en su conjunto y de cada monómero que lo compone, respectivamente; y aproximar la energía libre de unión utilizando la media de la diferencia entre la energía MM/PBSA del conjunto y la de los monómeros para toda la conformación. Este método puede utilizarse para analizar residuos de puntos activos que afectan a la afinidad del sustrato y también para predecir cambios en la selectividad del sustrato en mutantes.

4

Otros métodos

4.1

Acoplamiento molecular

El acoplamiento se refiere al proceso computacional de predecir la estructura (y afinidad) de un complejo basado en la estructura de un monómero. El acoplamiento de moléculas pequeñas con proteínas es una herramienta central para el cribado virtual de fármacos basado en la estructura, para lo cual se han desarrollado varios algoritmos [13]. Estos algoritmos y modelos también pueden aplicarse al acoplamiento de complejos sustrato-enzima. La detección virtual de fármacos requiere la consideración de un gran número de moléculas pequeñas diferentes y, por razones de eficiencia computacional, los cambios estructurales del receptor (o solo la cadena lateral) a menudo no se tienen en cuenta en los cálculos de acoplamiento molecular. A diferencia de la detección virtual, en los estudios de acoplamiento sustrato-enzima a menudo solo se consideran uno o varios sustratos diferentes, y los cambios estructurales en la enzima pueden, en principio, tenerse más en cuenta. La forma más directa de lograrlo es obtener diversas estructuras enzimáticas mediante métodos de muestreo conformacional como la MD, que se acoplan por separado al sustrato. En el acoplamiento sustrato-enzima, a menudo también es posible utilizar la disposición espacial relativa del sustrato y los grupos funcionales catalíticos para seleccionar/evaluar los resultados del acoplamiento.

4.2
Predicción de poros de moléculas pequeñas basados en la geometría

Numerosos estudios experimentales han revelado que algunas mutaciones alejadas del centro activo pueden tener un gran impacto en el rendimiento catalítico de las enzimas. Algunos de estos sitios pueden actuar alterando el poro de unión del sustrato/liberación del producto, y el tamaño del poro, las propiedades fisicoquímicas de los residuos alrededor del poro, etc. pueden cambiar la tasa de paso del sustrato/producto y afectar a la selectividad del sustrato. Los métodos de predicción de poros pueden utilizarse para encontrar residuos calientes relevantes y proporcionar una base para el diseño de bibliotecas de evolución dirigida. Existen varios métodos basados en estructuras geométricas para predecir las cavidades superficiales de las proteínas, las cavidades internas, los poros que conectan diferentes regiones, etc. [51-53]. Estos métodos utilizan estructuras espaciales estáticas como entradas y emplean principalmente métodos geométricos y de teoría de grafos para realizar la predicción con una alta eficiencia computacional.

4.3

Métodos de comparación de centros activos

Actualmente, se ha acumulado una gran cantidad de datos de estructuras 3D de enzimas con diferentes tipos y familias de estructuras en la Base de Datos de Estructuras 3D de Proteínas (PDB). Si comparamos diferentes enzimas, encontraremos que algunas de ellas tienen un alto grado de similitud en los centros activos (ejemplos típicos son los centros activos de la tríada catalítica compartidos por las serina proteasas), aunque las secuencias estructurales generales no sean similares. El método de comparación de la estructura del centro activo [54-55] puede utilizarse para recuperar automáticamente los centros activos de otras enzimas que son similares al centro activo de la enzima actual. Apilar múltiples centros activos similares en un espacio tridimensional y analizar las similitudes y diferencias entre diferentes centros activos puede proporcionar información valiosa para la selección del sitio de mutación.

5

Resumen

Para mayor claridad de la presentación, nuestra introducción de los métodos anteriores está categorizada. En la práctica, los diferentes tipos de métodos no son mutuamente excluyentes. Pueden utilizarse en combinación de muchas maneras para responder mejor a nuestras preguntas de interés. Por ejemplo, en las simulaciones de complejos enzima-sustrato, el acoplamiento molecular puede utilizarse para obtener la conformación inicial de la simulación; el conjunto de conformaciones obtenidas de las simulaciones MD puede utilizarse para el análisis de predicción de poros, acoplamiento molecular, simulaciones QM/MM, etc.; Los modelos MM que inscriben los estados de transición obtenidos de los modelos QM o QM/MM pueden construirse y utilizarse para simulaciones MD clásicas de larga duración para analizar los efectos del aumento y la disminución conformacionales en los procesos químicos, o para simular un gran número de mutantes para realizar una selección virtual de mutantes basada en simulaciones MD; el enfoque MM/PBSA, que ya hemos mencionado, es una combinación de MD y modelado de medios continuos, etc.
El estudio de sistemas de biomoléculas como las proteínas mediante métodos de química computacional tiene una historia de más de 40 años. Estos métodos se han utilizado cada vez más ampliamente en la investigación industrial de enzimas, al tiempo que se han desarrollado continuamente. Los equipos de investigación de China, tanto en química computacional como en ingeniería industrial de enzimas, se están expandiendo y sus capacidades de investigación están mejorando rápidamente. La aplicación de la química computacional en la ingeniería de enzimas se ampliará y profundizará a medida que la combinación cruzada de estas dos disciplinas se acerque cada vez más. La ingeniería de proteínas, la evolución dirigida y otras técnicas han tenido un gran impacto en la investigación industrial de enzimas. Se espera que el futuro desarrollo de métodos computacionales, especialmente el avance de nuevos métodos de diseño de enzimas, traiga nuevos avances tecnológicos para la investigación industrial de enzimas en la era de la biología sintética.

¡Contáctenos ahora!

Si necesita un precio, rellene sus datos de contacto en el siguiente formulario y, por lo general, nos pondremos en contacto con usted en un plazo de 24 horas. También puede enviarme un correo electrónico info@longchangchemical.com durante el horario laboral (de 8:30 a. m. a 6:00 p. m. UTC+8 de lunes a sábado) o utilice el chat en vivo del sitio web para obtener una respuesta rápida.

Compound Glucoamylase	9032-08-0
Pullulanase	9075-68-7
Xylanase	37278-89-0
Cellulase	9012-54-8
Naringinase	9068-31-9
β-Amylase	9000-91-3
Glucose oxidase	9001-37-0
alpha-Amylase	9000-90-2
Pectinase	9032-75-1
Peroxidase	9003-99-0
Lipase	9001-62-1
Catalase	9001-05-2
TANNASE	9025-71-2
Elastase	39445-21-1
Urease	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-Lactic dehydrogenase	9001-60-9
Dehydrogenase malate	9001-64-3
Cholesterol oxidase	9028-76-6