¿Cuáles son las características y aplicaciones de las diversas enzimas de las materias primas de DIV?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular utilizada para amplificar fragmentos específicos de ADN, lo que se considera una replicación del ADN fuera del organismo, mediante la cual se amplifican cantidades mínimas de fragmentos de ADN hasta tal punto que pueden identificarse y reconocerse fácilmente.
Para las reacciones de PCR, las «enzimas» desempeñan un papel crucial, y cada tipo de «enzima» tiene una actividad y función diferentes. Entonces, ¿qué tipos de enzimas existen? ¿Y cuáles son las aplicaciones en el campo del DIV?
ADN polimerasa
Definición: Es un tipo de enzima que utiliza el ADN como plantilla, se replica desde el extremo 5 al extremo 3 del ADN y cataliza la polimerización de las moléculas de dNTP del sustrato para formar ADN hijo.
Principales actividades y funciones: catalizar la síntesis de ADN. 1, polimerización. 2, 3, → 5, actividad exonucleasa – función de corrección de pruebas 3, 5, → 3, actividad exonucleasa – función de reparación por escisión 4, función de hidrólisis de pirofosfato 5, intercambio de pirofosfato.
Las ADN polimerasas comunes en el campo de los DIV incluyen: enzima Taq de inicio en caliente, que utiliza la modificación química para cerrar la actividad de la enzima Taq antes de que el sistema de reacción se caliente a 70 °C, inhibiendo así la amplificación inespecífica. ADN polimerasa de alta fidelidad, que contiene un centro de polimerización y un centro de escisión, el centro de polimerización tiene una actividad polimerasa 5′-3′, responsable de la polimerización; el centro de escisión tiene una actividad exonucleasa 3′-5′ (también conocida como actividad de corrección), responsable de la escisión de los nucleótidos no apareados. (también conocida como actividad de corrección), que es responsable de la escisión de los nucleótidos no apareados.
transcriptasa inversa
Definición: enzima que utiliza ARN como molde y sintetiza una sola hebra de ADN complementaria al molde de ARN en la dirección 5′-3′.
Principales actividades y funciones: 1. Actividad de la ADN polimerasa dirigida por ARN. 2. Actividad de la ARNasa H. 3. Actividad de la ADN polimerasa dirigida por ADN.
Aplicación en el campo del diagnóstico in vitro: 1, reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) 2, construcción de bibliotecas de ADNc 3, secuenciación de ARN 4, RT-qPCR, 2019 Los nuevos reactivos del sistema de detección de ácidos nucleicos de New Crown se unirán inevitablemente a la transcriptasa inversa. Esto se debe a que los virus de ARN deben transcribirse inversamente a ADN para realizar reacciones de PCR.
ARN polimerasa
Definición: una cadena de ADN o ARN como plantilla polimerasa, porque en la célula con la información genética de la transcripción del ADN, también conocida como transcriptasa.
Actividades y funciones principales: 1, con el ADN como plantilla; 2, cataliza la síntesis de ácidos nucleicos a través de reacciones de polimerización; 3, hace que los nucleótidos formen enlaces 3,→5,-fosfodiéster; 4, transcribe la secuencia de la plantilla en la dirección 5′-3′ según el principio de emparejamiento complementario de bases.
Las ARN polimerasas comunes en el campo del DIV incluyen la ARN polimerasa T7, que cataliza específicamente el proceso de formación de ARN en la dirección 5’→3′. Actualmente, en el diagnóstico in vitro, la tecnología SAT es la aplicación de la ARN polimerasa T7 para la amplificación de ARN. Esta tecnología se ha utilizado ampliamente en la detección de patógenos, el cribado de virus sanguíneos y la detección de microbios ambientales.
Proteinasa K
Definición: La proteinasa K es una potente enzima proteolítica aislada de Candida albicans y es un reactivo clave para la extracción de ADN.
Función principal: degradar las proteínas de membrana y las proteínas unidas al ADN, y promover la liberación del ADN. Aplicación en el campo del diagnóstico in vitro: para el aislamiento y la extracción de plásmidos, ADN genómico y ARN. En la detección de ácido nucleico viral, la proteinasa K puede escindir e inactivar las proteínas de la cápside viral, al tiempo que libera el genoma viral para completar la extracción del ácido nucleico.
UDG Enzima
Definición: alias uracil-ADN glicosilasa, también conocida como uracil-N-glicosilasa o UNGasa. Es la estructura química que forma los monómeros de ADN y ARN y codifica la información genética.
Función: control eficiente de la contaminación residual por PCR. Aplicación en IVD: los reactivos de PCR para pruebas clínicas contienen la enzima UDG para prevenir la contaminación.
Endonucleasa
Definición: clase de enzimas que reconocen una secuencia de nucleótidos específica y cortan el enlace fosfodiéster entre dos desoxirribonucleótidos en un sitio específico de cada cadena, denominadas enzimas de restricción.
Función: existen 3 tipos: tipo 1: tanto modificación como corte de reconocimiento, el sitio de corte está lejos de la secuencia de reconocimiento. tipo 2: solo corte de reconocimiento, el sitio de corte es la secuencia de reconocimiento. tipo 3: tanto modificación como corte de reconocimiento, el sitio de corte y la secuencia de reconocimiento están más cerca.
Aplicaciones en el campo del diagnóstico in vitro: 1, localización de genes y aislamiento de genes, 2, análisis de secuencias de bases moleculares de ADN, 3, edición de ingeniería genética, 4, formación de mapas físicos de ADN.
Enzima desconjugadora
Definición: utiliza la energía proporcionada por la hidrólisis del ATP para desenredar los enlaces de hidrógeno formados por el emparejamiento de nucleótidos de ADN bicatenario para formar ADN monocatenario.
Función: desempeña un papel en la catálisis de la desconvulgaración del ADN o ARN durante la replicación del ADN o ARN.
Aplicación en el campo del DIV: Tecnología de amplificación isotérmica, que utiliza una enzima desconjugadora termoestabilizada en lugar del proceso de desnaturalización térmica en la qPCR, para desenredar la doble cadena y prolongar la amplificación. Esta técnica es menos propensa a la amplificación inespecífica y también evita el proceso de elevar y bajar la temperatura en el ciclo de PCR, requiriendo solo un equipo sencillo para la detección.
Enzima modificadora
Definición: enzima que cataliza la incorporación de bases poco frecuentes en el ARN o el ADN, o modifica las bases originales para evitar su destrucción por endonucleasas de restricción.
Función: modificación covalente de la estructura de otras enzimas para que se transformen entre sí entre una forma muy activa y una forma relativamente menos activa.
Aplicación en IVD: Ensayo de actividad enzimática modificadora de ácido nucleico 5mC/m6A. El método HTMR proporciona pruebas sólidas para el descubrimiento y la evaluación de la actividad de los moduladores de moléculas pequeñas dirigidos a la metilación del ADN/ARN.
Pirofosfatasa
DEFINICIÓN: enzima que cataliza la conversión de una molécula de pirofosfato en dos moléculas de iones fosfato.
FUNCIÓN: la pirofosfatasa inorgánica termoestable sigue siendo 100 % activa cuando se calienta a 100 °C durante 4 h, por lo que puede utilizarse en reacciones de PCR para eliminar la inhibición de la PCR por el pirofosfato inorgánico generado y mejorar la replicación del ADN.
Anticuerpo Taq
Definición: Anticuerpo contra la ADN polimerasa Taq.
Función: Durante la amplificación por PCR, el anticuerpo Taq se une a la enzima Taq para inhibir la actividad de la ADN polimerasa antes de la desnaturalización a alta temperatura, y puede inhibir eficazmente el anillamiento inespecífico de cebadores y la amplificación inespecífica causada por el dímero de cebador a baja temperatura.
Aplicación en IVD: La alta eficiencia de contención del anticuerpo Taq puede mejorar la sensibilidad de detección del nuevo kit de detección de ácido nucleico del coronavirus y ayudar a la detección del nuevo coronavirus.
El proceso estándar de PCR se divide en tres pasos: Desnaturalización, hibridación y extensión del ADN. La reacción de inactivación puede producirse al comienzo de la PCR calentando a 50 °C durante 10 minutos o a 95 °C durante 2 minutos, y la enzima UDG elimina la amplificación generada por el ADN contaminante en el sistema de reacción. Posteriormente, el ADN molde se desnaturaliza a ADN monocatenario a alta temperatura. Dos cebadores se hibridan con dos cadenas de ADN molde respectivamente bajo la acción de la ADN polimerasa y a una temperatura adecuada. Los cebadores se extienden de nuevo bajo la ADN polimerasa. El anticuerpo Taq se une a la enzima Taq para inhibir la actividad de la ADN polimerasa e inhibir la amplificación inespecífica a bajas temperaturas. La adición de pirofosfatasa inorgánica a la reacción de PCR hidroliza el pirofosfato a ortofosfato, aumentando la eficiencia de amplificación de la reacción.
La enzima como materia prima es la cadena industrial ascendente de la industria de pruebas moleculares. En 2020, ante la enorme demanda de pruebas de ácido nucleico, la demanda del mercado de reactivos de diagnóstico molecular aumentó drásticamente y, como resultado, la industria de enzimas como materia prima se ha desarrollado rápidamente. En términos de producción, debido al alto umbral técnico de la producción de enzimas como materia prima para pruebas moleculares, el mercado interno actual depende principalmente de las importaciones. En los últimos años, junto con el aumento del proceso de producción nacional, se han incorporado varias empresas de materias primas, y las categorías de productos también se han ido enriqueciendo gradualmente, pero es innegable que la industria nacional de materias primas para diagnóstico in vitro se encuentra todavía en las primeras etapas de desarrollo, la cuota de mercado también es relativamente pequeña y el futuro está destinado a existir en un espacio mayor de mejora.
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| Compound Glucoamylase | 9032-08-0 |
| Pullulanase | 9075-68-7 |
| Xylanase | 37278-89-0 |
| Cellulase | 9012-54-8 |
| Naringinase | 9068-31-9 |
| β-Amylase | 9000-91-3 |
| Glucose oxidase | 9001-37-0 |
| alpha-Amylase | 9000-90-2 |
| Pectinase | 9032-75-1 |
| Peroxidase | 9003-99-0 |
| Lipase | 9001-62-1 |
| Catalase | 9001-05-2 |
| TANNASE | 9025-71-2 |
| Elastase | 39445-21-1 |
| Urease | 9002-13-5 |
| DEXTRANASE | 9025-70-1 |
| L-Lactic dehydrogenase | 9001-60-9 |
| Dehydrogenase malate | 9001-64-3 |
| Cholesterol oxidase | 9028-76-6 |