Resumen de los métodos de inmovilización de enzimas
En el artículo anterior, mencionamos que las sustancias amargas de los cítricos son principalmente naringina, que puede descomponerse gradualmente en glucosa y naringenina mediante la naringinasa, y finalmente lograr el objetivo de eliminar el amargor. En el proceso real de producción y uso, en comparación con las enzimas libres, las enzimas inmovilizadas no solo tienen una mayor eficiencia catalítica y una mejor especificidad, sino que también mejoran la resistencia a condiciones adversas y prolongan la vida útil de las enzimas; al mismo tiempo, las enzimas inmovilizadas son fáciles de separar del producto de la reacción, simplifican el proceso de producción y reducen el coste. Por lo tanto, a continuación se ofrece una breve introducción a los métodos de inmovilización de las enzimas comunes.
Las enzimas inmovilizadas son enzimas que se fijan a un determinado soporte para formar una sustancia insoluble en agua y que siguen conservando sus propiedades catalíticas. Ya en 1954, Glubhofer y Schleith utilizaron el método diazo para modificar la resina de poliestireno con el fin de inmovilizar la pepsina y la carboxipeptidasa y preparar enzimas inmovilizadas. Luego, en 1969, el científico japonés Chi Yanichiro utilizó aminoácidos acilados inmovilizados para lograr por primera vez la producción continua de L-aminoácidos, lo que promovió el rápido desarrollo de la tecnología de inmovilización en la ingeniería enzimática. Cuando aparecieron las enzimas inmovilizadas, existían muchos nombres diferentes, pero en la primera Conferencia Internacional de Ingeniería Enzimática, celebrada en 1971, se propuso formalmente utilizar «enzimas inmovilizadas» como término adecuado. La reacción catalizada por enzimas tiene condiciones suaves, alta eficiencia catalítica y alta especificidad. Al mismo tiempo, la enzima es fácil de degradar y es respetuosa con el medio ambiente. La enzima inmovilizada no solo conserva estas características de la enzima, sino que también tiene muchas propiedades que son difíciles de poseer para las enzimas libres, tales como: ① fácil separación del sistema de reacción; ② reciclable para su reutilización; ③ mejora de la estabilidad de la enzima en condiciones adversas; ④ puede realizar la catálisis enzimática en fase no acuosa; ⑤ puede producir un sistema multienzimático con reacción continua. Dado que las enzimas inmovilizadas pueden tener un importante valor aplicativo en los campos de la medicina, la alimentación y la protección del medio ambiente, entre otros, han atraído la atención de los estudiosos en los últimos años y tienen muchas aplicaciones en la industria.
Los métodos comunes de inmovilización de enzimas incluyen principalmente el método de adsorción, el método de incrustación, el método de reticulación y el método de acoplamiento covalente. Los dos primeros pertenecen al método físico y los dos últimos al método químico. El principio de estos métodos para inmovilizar enzimas se muestra en la figura 1.
Figura 1. Método de inmovilización de enzimas
1. Método de adsorción
El método de adsorción es un método para completar la inmovilización mediante la adsorción superficial del portador a la enzima o mediante la interacción de cargas positivas y negativas entre el portador y la enzima, incluyendo la adsorción física y la adsorción iónica.
- Adsorción física
El método de adsorción física es un método para fijar la enzima en la superficie del portador utilizando el efecto de adsorción del portador sobre la enzima. El método es sencillo de operar, no requiere modificación ni activación, y el centro activo de la enzima se conserva bien, pero la fuerza de unión es baja y su fuerza es principalmente intermolecular y de tensión superficial. Los adsorbentes comúnmente utilizados para la inmovilización de enzimas incluyen carbón activado, grafeno, tierra de diatomeas y otros adsorbentes no solubles en agua con gran capacidad de absorción de agua. Zhao et al. utilizaron óxido de grafeno reducido como soporte para co-inmovilizar glucosa oxidasa y glucoamilasa y preparar una enzima compuesta inmovilizada.
- adsorción iónica
El método de adsorción iónica es un método de inmovilización de la enzima mediante la interacción de cargas positivas y negativas entre el soporte y la enzima. El método tiene condiciones de preparación suaves y la actividad enzimática no se pierde fácilmente, pero la fuerza de unión también es débil y fácil de desprenderse. Mateo et al. prepararon un nuevo tipo de resina de intercambio iónico para fijar lipasa, β-galactosidasa y aminoácido oxidasa, respectivamente. En condiciones de pH 7,0 y 4 ℃, la enzima puede alcanzar la saturación de adsorción en pocos minutos, y la tasa de recuperación de la actividad enzimática alcanza el 100 %, lo que demuestra un buen efecto de inmovilización.
2 Método de incrustación
El método de incrustación es un método en el que la enzima se incrusta en un material poroso, e incluye el método de incrustación en gel y el método de incrustación en membrana semipermeable. El método de incrustación en gel es un método de fijación en el que la enzima se incrusta en la estructura de red interna del gel (Figura 1B-a). Zhang Shuxiang y otros utilizaron alginato de sodio para incrustar la lacasa fúngica para tratar aguas residuales de fabricación de papel de baja concentración. La tasa máxima de recuperación de la actividad enzimática fue del 48 %, y la actividad enzimática se mantuvo en un 64 % después de 8 ciclos. El método de incrustación en membrana semipermeable es un método de inmovilización de enzimas en una membrana semipermeable hecha de polímeros de alto peso molecular (Figura 1B-b). Este método tampoco requiere modificación química y no afecta a la actividad de la enzima, pero no es fácil controlar el tamaño de la membrana. Es difícil mantener la actividad enzimática mientras se controla la libre entrada y salida de reactivos y productos sin que se produzcan fugas de enzimas. Por lo tanto, este método se suele combinar con otros métodos en la práctica. Rilling P et al. utilizaron un portador para inmovilizar moléculas de proteína juntas en una microcápsula, lo que no solo aumentó la estabilidad de la enzima inmovilizada, sino que también mejoró sus propiedades.
3 Método de reticulación
El método de reticulación es un método en el que las moléculas enzimáticas se reticulan entre sí utilizando reactivos bifuncionales o multifuncionales, y las moléculas enzimáticas y los reactivos forman un enlace covalente y se fijan. La enzima inmovilizada preparada por este método tiene una buena estabilidad, pero algunos grupos de la enzima, como amino, sulfhidrilo, imidazolilo, etc., pueden participar en la reacción de reticulación. Si el agente de reticulación y el grupo funcional seleccionados no son adecuados, la estructura del centro activo de la enzima puede destruirse, lo que da lugar a una pérdida grave de la actividad enzimática, por lo que este método suele combinarse con otros métodos. Li Xiaojing y otros encapsularon primero la pepsina con una solución de alginato de sodio, luego la añadieron gota a gota a una solución que contenía una determinada concentración de quitosano y CaCl2 para obtener microesferas de enzima inmovilizada, y a continuación añadieron una cierta cantidad de glutaraldehído para la reticulación y obtener pepsina inmovilizada. Este método permitió obtener una enzima inmovilizada con buena estabilidad operativa y térmica.
4 Método de acoplamiento covalente
El método de acoplamiento covalente (también conocido como método de unión covalente) es un método para inmovilizar la enzima mediante la formación de un enlace covalente entre la enzima y el portador (como se muestra en la figura 2).
Figura 2. Enzima inmovilizada mediante un método de unión covalente. A: residuo de aminoácido activo; B: grupo de unión en el portador; C: portador.
Los métodos de unión covalente incluyen generalmente tres tipos: (1) el portador se modifica y se activa, y luego se une covalentemente a la molécula enzimática; (2) el portador y la molécula enzimática se unen covalentemente a través de un agente de acoplamiento; (3) la molécula enzimática se modifica después de la activación y se combina con el portador. Entre ellos, el primer tipo es el más utilizado. Después de activar el portador para conectar ciertos grupos activos, como amino, epoxi, etc., al residuo activo de la molécula enzimática (como amino, carboxilo, hidroxilo, etc.), la enzima queda inmovilizada. Este método es mucho más fiable que el método de adsorción. Al mismo tiempo, dado que el portador suele ser más grande, los residuos de aminoácidos que participan en la reacción sobre la enzima son generalmente los que están expuestos en la periferia de la enzima, y el efecto sobre el centro activo de la enzima es relativamente pequeño. Este es un método excelente para inmovilizar enzimas. Yan Keliang y otros utilizaron nanopartículas magnéticas aminosilanizadas para inmovilizar la pectinasa, y la tasa de inmovilización y la tasa de recuperación de la actividad enzimática fueron del 44,44 % y del 40,86 %, respectivamente, lo que permitió obtener un buen efecto de inmovilización. En el siguiente artículo se seguirán presentando en detalle los diferentes métodos de preparación de microesferas magnéticas de biopolímeros.
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| Compound Glucoamylase | 9032-08-0 |
| Pullulanase | 9075-68-7 |
| Xylanase | 37278-89-0 |
| Cellulase | 9012-54-8 |
| Naringinase | 9068-31-9 |
| β-Amylase | 9000-91-3 |
| Glucose oxidase | 9001-37-0 |
| alpha-Amylase | 9000-90-2 |
| Pectinase | 9032-75-1 |
| Peroxidase | 9003-99-0 |
| Lipase | 9001-62-1 |
| Catalase | 9001-05-2 |
| TANNASE | 9025-71-2 |
| Elastase | 39445-21-1 |
| Urease | 9002-13-5 |
| DEXTRANASE | 9025-70-1 |
| L-Lactic dehydrogenase | 9001-60-9 |
| Dehydrogenase malate | 9001-64-3 |
| Cholesterol oxidase | 9028-76-6 |