Resumen de los métodos de inmovilización enzimática

Respuesta rápida: Para temas de enzimas, levaduras, quitosano e ingredientes alimentarios, los compradores suelen comparar la actividad o funcionalidad junto con la estabilidad, las condiciones de aplicación y el impacto en la calidad posterior.

En el artículo anterior, mencionamos que las sustancias amargas en los cítricos son principalmente naringina, que la naringinasa puede descomponer gradualmente en glucosa y naringenina, y finalmente lograr el propósito de desamargar. En el proceso de producción y uso real, en comparación con las enzimas libres, las enzimas inmovilizadas no solo tienen una mayor eficiencia catalítica y una mejor especificidad, sino que también mejoran la resistencia a condiciones duras y prolongan la vida útil de las enzimas; al mismo tiempo, es conveniente separar las enzimas inmovilizadas del producto de reacción, simplificar el proceso de producción y reducir el costo. Por lo tanto, aquí hay una breve introducción a los métodos de inmovilización de enzimas comunes.

Ienzima inmovilizada se refiere a una enzima que se fija en un determinado portador para formar insolubilidad en agua y aún tiene propiedades catalíticas. Ya en 1954, Glubhofer y Schleith utilizaron el método diazo para modificar la resina de poliestireno para la inmovilización de pepsina y carboxipeptidasa para preparar enzimas inmovilizadas. Luego, en 1969, el científico japonés Chi Yanichiro utilizó por primera vez un aminoácido acilado inmovilizado para realizar una producción continua de L-aminoácido, lo que promovió el rápido desarrollo de la tecnología de inmovilización en la ingeniería enzimática. Cuando aparecieron las enzimas inmovilizadas, había muchos nombres diferentes, pero en la primera Conferencia Internacional de Ingeniería Enzimática en 1971, se propuso formalmente utilizar «enzimas inmovilizadas» como término adecuado. La reacción catalizada por enzimas tiene condiciones suaves, alta eficiencia catalítica y alta especificidad. Al mismo tiempo, la enzima es fácil de degradar y respetuosa con el medio ambiente. La enzima inmovilizada no solo conserva estas características de la enzima, sino que también tiene muchas propiedades que son difíciles de poseer para las enzimas libres, como: ① fácil de separar del sistema de reacción; ② reciclable para reciclaje; ③ mejorar la estabilidad de la enzima en condiciones adversas; ④ Puede realizar catálisis enzimática en fase no acuosa; ⑤ Puede producir un sistema multienzimático con reacción continua. Porque las enzimas inmovilizadas pueden tener un valor de aplicación importante en los campos de la medicina, la alimentación, la protección del medio ambiente, etc., han atraído la atención de los académicos en los últimos años y tienen muchas aplicaciones en la industria.

Los métodos comunes de inmovilización de enzimas incluyen principalmente el método de adsorción, el método de inclusión, el método de reticulación y el método de acoplamiento covalente. Los dos primeros pertenecen al método físico y los dos últimos al método químico. El principio de esos métodos para inmovilizar la enzima se muestra en la Figura 1.

Figura 1 Método de inmovilización de la enzima

1 Método de adsorción

El método de adsorción es un método para completar la inmovilización mediante la adsorción superficial del portador a la enzima o mediante la interacción de carga positiva y negativa entre el portador y la enzima, incluida la adsorción física y la adsorción de iones.

• adsorción física

El método de adsorción física es un método para fijar la enzima en la superficie del portador utilizando el efecto de adsorción del portador sobre la enzima. El método es simple de operar, no requiere modificación ni activación, y el centro activo de la enzima está bien conservado, pero la fuerza de unión es baja y su fuerza es principalmente fuerza intermolecular y tensión superficial. Los adsorbentes comúnmente utilizados para la inmovilización de enzimas incluyen carbón activado, grafeno, tierra de diatomeas y otros adsorbentes no solubles en agua con una fuerte capacidad de absorción de agua. Zhao y cols. utilizó óxido de grafeno reducido como portador para co-inmovilizar la glucosa oxidasa y la glucoamilasa para preparar una enzima compuesta inmovilizada.

• Adsorción de iones

El método de adsorción de iones es un método para inmovilizar la enzima a través de la interacción de carga positiva y negativa entre el portador y la enzima. El método tiene condiciones de preparación suaves y la actividad enzimática no es fácil de perder, pero la fuerza de unión también es débil y fácil de perder. Mateo et al. preparó un nuevo tipo de resina de intercambio iónico para fijar lipasa, β-galactosidasa y aminoácido oxidasa, respectivamente. En condiciones de pH 7,0 y 4 ℃, la enzima puede alcanzar la saturación de adsorción en unos pocos minutos y la tasa de recuperación de la actividad enzimática hasta el 100 %, lo que muestra un buen efecto de inmovilización.

2 Método de incrustación

El método de inclusión es un método en el que la enzima se incrusta en un material poroso e incluye el método de inclusión en gel y el método de inclusión en membrana semipermeable. El método de inclusión en gel es un método de fijación en el que la enzima se incrusta en la estructura de red interna del gel (Figura 1B-a). Zhang Shuxiang y otros utilizaron alginato de sodio para incorporar lacasa fúngica para tratar aguas residuales de baja concentración de la fabricación de papel. La tasa máxima de recuperación de la actividad enzimática fue del 48% y la actividad enzimática se mantuvo en el 64% después de 8 ejecuciones. El método de inclusión de membrana semipermeable es un método para inmovilizar enzimas en una membrana semipermeable hecha de polímeros de alto peso molecular (Figura 1B-b). Este método tampoco requiere modificación química y no afecta la actividad de la enzima, pero no es fácil controlar el tamaño de la membrana. Es difícil mantener la actividad enzimática mientras se controla la libre entrada y salida de reactivos y productos sin fuga de enzima. Por lo tanto, este método suele combinarse con otros métodos en el uso práctico. Rilling P et al. utilizó un portador para inmovilizar moléculas de proteínas juntas en una microcápsula, lo que no solo aumentó la estabilidad de la enzima inmovilizada, sino que también mejoró sus propiedades.

3 Método de reticulación

El método de reticulación es un método en el que las moléculas de enzima se entrecruzan entre sí utilizando reactivos bifuncionales o multifuncionales, y las moléculas de enzima y los reactivos forman un enlace covalente y se fijan.. La enzima inmovilizada preparada mediante este método tiene buena estabilidad, pero algunos grupos de la enzima, como amino, sulfhidrilo, imidazolilo, etc., pueden participar en la reacción de reticulación. Si el agente reticulante y el grupo funcional seleccionados no son apropiados, la estructura del centro activo de la enzima puede destruirse, lo que resulta en una pérdida grave de la actividad enzimática, por lo que este método generalmente se combina con otros métodos. Li Xiaojing y otros primero encapsularon pepsina con una solución de alginato de sodio, luego la agregaron gota a gota a una solución que contenía una cierta concentración de quitosano y CaCl₂ para obtener microesferas de enzimas inmovilizadas, luego agregaron una cierta cantidad de glutaraldehído para realizar reticulación y obtener pepsina inmovilizada. Este método obtuvo una enzima inmovilizada con buena estabilidad operativa y estabilidad térmica.

4 Método de acoplamiento covalente

El método de acoplamiento covalente (también conocido como método de unión covalente) es un método para inmovilizar la enzima formando un enlace covalente entre la enzima y el portador (como se muestra en la Figura 2).

Figura 2 Enzima inmovilizada mediante método de unión covalente, residuo de aminoácido activo A; grupo de unión B en el portador; Portador C.

Los métodos de unión covalente generalmente incluyen tres tipos: (1) el portador se modifica y activa, y luego se une covalentemente a la molécula de enzima; (2) el vehículo y la molécula de enzima están unidos covalentemente a través de un agente de acoplamiento; (3) la molécula de enzima se modifica después de la activación y se combina con el portador. Entre ellos, el primer tipo es el más utilizado. Después de activar el portador para conectar ciertos grupos activos como amino, epoxi, etc., al residuo activo de la molécula de enzima (como amino, carboxilo, hidroxilo, etc.), la enzima se inmoviliza. Este método es mucho más fiable que el método de adsorción. Al mismo tiempo, debido a que el portador suele ser más grande, los residuos de aminoácidos involucrados en la reacción de la enzima son generalmente los expuestos en la periferia de la enzima y el efecto sobre el centro activo de la enzima es relativamente pequeño.Este es un excelente método para inmovilizar enzimas. Yan Keliang y otros utilizaron nanopartículas magnéticas aminosilanizadas para inmovilizar la pectinasa, y la tasa de inmovilización y la tasa de recuperación de la actividad enzimática fueron del 44,44% y 40,86%, respectivamente, logrando un buen efecto de inmovilización. El próximo artículo continuará presentando en detalle los diferentes métodos de preparación de microesferas de biopolímeros magnéticos.