La eficiencia del carbono es uno de los principales factores que definen la viabilidad de un proceso de ruta y es el principal determinante de la tasa de producto por unidad de sustrato. Dos factores determinan la eficiencia del carbono: el equilibrio electrónico entre el sustrato y el producto, que puede calcularse a partir del grado de reducción del sustrato y el producto, y el hecho de que las vías metabólicas existentes están diseñadas principalmente para velocidades de reacción más altas en lugar de altos rendimientos de carbono. El primer factor está estrechamente relacionado con la composición química del sustrato y del producto. El segundo factor se puede superar rediseñando la ruta metabólica, lo que permite retener o, en algunos casos, asimilar el carbono del sustrato durante la formación del producto.

1. Equilibrio redox en el metabolismo yeast La eficiencia de las vías metabólicas necesarias para la producción biológica eficiente de sustancias químicas depende de una variedad de factores como el equilibrio redox, el equilibrio energético, la viabilidad termodinámica, el equilibrio estequiométrico, el acoplamiento de flujo, la inhibición de la retroalimentación, la toxicidad del producto, la cinética, etc. El metabolismo celular mantiene el crecimiento celular y el equilibrio redox transfiriendo electrones desde sustratos a diferentes metabolitos. Por lo tanto, la vía biosintética óptima para la producción de un metabolito deseado debe ser redox neutra y el rendimiento de la vía (YP) debe ser igual o muy cercano al rendimiento teórico máximo (YE) de la combinación sustrato-producto objetivo. El YP depende de la vía involucrada y se determina en función de su estequiometría, mientras que el YE es la cantidad máxima de producto que se puede formar a partir del sustrato y se puede calcular a partir de la relación sustrato-producto. γS/γP calculado donde γS y γP son el grado de reducción del sustrato y del producto, respectivamente. El grado de reducción se puede definir como el número de equivalentes de electrones disponibles por átomo de carbono del compuesto. Por lo tanto, YE debe tener en cuenta el equilibrio electrónico para la conversión de un sustrato en un producto, lo que puede requerir una descarboxilación que provoque una pérdida de carbono o una carboxilación para proporcionar una absorción adicional de carbono. La siguiente figura muestra la vía metabólica del centro de levadura. Figura 1. Ruta metabólica del carbono central de la levadura, destacando la relación entre los pasos de carboxilación/descarboxilación y los cambios en el grado de reducción del sustrato y del producto. El grado de reducción de los sustratos, metabolitos intermedios y productos correspondientes se indica mediante el cambio de color del rojo (γ=0) al amarillo (γ=4) y al azul (γ=6).Según el grado de reducción del sustrato y el producto objetivo, se puede dividir en tres casos: cuando el sustrato y el producto objetivo tienen el mismo grado de reducción, existe una situación ideal en la que el sustrato se convierte completamente en producto. Es decir, el rendimiento real del producto puede estar cerca del rendimiento teórico máximo (YE), pero el proceso metabólico producirá subproductos para la formación de biomasa y el mantenimiento del crecimiento celular, lo que reducirá el rendimiento del producto. Un ejemplo es el ácido láctico (γ = 4,0), que tiene el mismo grado de reducción que la glucosa (γ = 4,0). Por lo tanto, el proceso de producción de lactato es una vía redox neutra con una estequiometría equilibrada, al tiempo que permite la generación de ATP, lo que da como resultado una tasa cercana al rendimiento máximo teórico. En general, para otros productos de sustrato, es raro encontrar vías que no generen un poder reductor excesivo.
Cuando el producto está más reducido que el sustrato, las reacciones de oxidación necesarias para formar el producto generan equivalentes oxidativos adicionales (NAD+, NADP+, FADH+). Para reducir estos equivalentes oxidativos, la célula necesita oxidar carbono a CO2 y/u otros subproductos (p. ej., en la vía de las pentosas fosfato (PPP), el ciclo del TCA o el ciclo de la xilulosa fosfato (XuMP)) para mantener la homeostasis redox. Este proceso puede afectar la eficiencia general de la conversión del sustrato en productos objetivo. Los ejemplos incluyen ácidos grasos, etanol y glicerol.
El uso de glucosa como sustrato para generar ácidos grasos, como el ácido palmítico (γ = 5,75), reduce la producción de ácidos grasos debido a los altos requisitos de NADPH y la liberación de CO2 durante la extensión de la cadena de carbono, lo que conduce a la pérdida de sustrato. Yu et al [1] lograron aumentar la producción de ácidos grasos en Saccharomyces cerevisiae hasta un 40% mediante la construcción de una vía metabólica reductora anabólica caracterizada por un ciclo de descarboxilación repetitivo para suministrar el célula con NADH, NADPH y ATP adicionales.
La producción de etanol a partir de glucosa también oxida algunos sustratos a CO2 y glicerol debido a la necesidad de suministrar NADH. Sin embargo, la vía natural de la levadura para fermentar el etanol conserva el grado de reducción de la glucosa (γ = 4,0), con una reducción promedio general de γ = 4,0 cuando el CO2 y el etanol son los productos finales. Por lo tanto, la vía metabólica es muy eficiente desde una perspectiva de rendimiento, ya que convierte solo del 4 al 5 % de la fuente de carbono en glicerol. De manera similar, cuando la levadura de cerveza produjo 1,2-propanodiol (1,2-PDO) (γ=5,33) usando glicerol (γ=4,66) como única fuente de carbono, la modificación de ingeniería metabólica proporcionó NADH adicional para facilitar la síntesis de 1,2-PDO, logrando los rendimientos más altos hasta la fecha en levadura de >4 g/L de 1,2-PDO.Cuando el producto se reduce por debajo del sustrato, durante la producción del producto se generan tanto equivalentes reductores como producto. Un mecanismo común para reoxidar el exceso de equivalentes reductores es a través de la oxidación por la cadena respiratoria, generando un exceso de ATP y/o liberando calor. Como resultado, el rendimiento del producto está por debajo del máximo teórico alcanzable con los electrones disponibles. Alternativamente, el exceso de equivalentes reductores se puede consumir reduciendo parte de la fuente de carbono a subproductos reductores. Esta combinación de sustrato y producto tiene el potencial de fijar carbono para aumentar el rendimiento del metabolito objetivo. Al igual que en la producción de ácido cítrico (γ = 3,0) a partir de glucosa, el desbordamiento de energía debido a la formación de NADH significa que la célula puede simplemente ganar energía produciendo el compuesto objetivo a costa de una pérdida de rendimiento. Por lo tanto, la escasa eficiencia de la vía bioquímica natural para la síntesis de ácido cítrico representa una oportunidad para alcanzar una tasa de ganancia cercana a la máxima teórica que se puede lograr mediante la fijación de carbono.
Por lo tanto, los sustratos para usar en el producto deseado se pueden seleccionar basándose en γS y γP que maximizan el rendimiento. El sustrato preferido de la levadura, la glucosa, se puede utilizar para sintetizar productos con el mismo γ que la glucosa, como el etanol (más CO2) o el ácido láctico. Aunque la glucosa es el sustrato preferido, la glucosa compite directamente con la producción de alimentos o piensos. Por lo tanto, varias fuentes de carbono más baratas, como el glicerol, el metanol y el CO2, se consideran sustratos prometedores.
El metanol (γ = 6,0) es una materia prima C1 con un alto grado de reducción. Una de las principales ventajas de utilizar metanol como fuente de carbono es su poder reductor, que en microorganismos como la levadura metilotrófica forma NADH y genera ATP. Sin embargo, dado que la primera reacción de la vía es la oxidación del metanol a formaldehído utilizando oxígeno como aceptor de electrones, la levadura pierde un NADH por cada porción de metanol consumida. Estudios recientes han demostrado que Komagataella phaffii pudo utilizar el metanol de manera más eficiente al sobreexpresar metanol deshidrogenasa endógena (Adh2) en una cepa deficiente en alcohol oxidasa (Mut-), lo que resultó en la producción de NADH y ATP adicionales por porción de metanol. Esto permitió a la cepa Mut-Adh2 aumentar la intensidad de producción de proteínas heterólogas en condiciones de bajo consumo de oxígeno y emisión de calor.
Otra fuente de carbono prometedora es el CO2, que es un compuesto altamente oxidado (γ=0) que los autótrofos pueden reducir para producir compuestos orgánicos para la biosíntesis. Por lo tanto, una forma de introducir CO2 en el metabolismo de la levadura es la conversión de cosustrato, que convierte el CO2 junto con otra fuente de carbono en un producto con un menor grado de reducción que el cosustrato.En la biosíntesis de ácidos orgánicos, que tienen un γ menor que la glucosa, como los ácidos cítrico, maleico y succínico, esta estrategia permite la incorporación de CO2 en los procesos de fermentación industrial para aumentar el rendimiento de carbono.

2. ¿Cómo equilibrar el grado de reducción del producto? La evolución de los procesos metabólicos en los microorganismos suele basarse en el rápido crecimiento de las células más que en la producción de productos específicos. Por lo tanto, la célula prefiere un metabolismo rápido a un alto rendimiento de carbono. Por lo tanto, la capacidad de las células para mejorar la retención de carbono durante el metabolismo es uno de los mayores desafíos en la ingeniería metabólica, que impide que las fábricas microbianas logren una producción química de alto rendimiento. Este artículo analiza la ingeniería metabólica de la levadura destinada a maximizar la retención de carbono, incluida la fijación de CO2, así como evitar pasos de descarboxilación no esenciales en la célula. 2.1 Integración del carbono inorgánico en el metabolismo celular utilizando CO2 como sustrato. Existen diferentes vías: una molécula de CO2 forma compuestos orgánicos mediante carboxilación; El CO2 se convierte por reducción en ácido fórmico o CO, que puede asimilarse a biomasa. Las reacciones de carboxilación son catalizadas por carboxilasas. como RuBisCO en el ciclo CBB de la vía autótrofa de fijación de CO2 o las enzimas de la vía Pck y Pyc, que participan en el suministro de precursores metabólicos centrales. El principio de reducción de carbono es que el CO2 se reduce a ácido fórmico o CO mediante la formiato deshidrogenasa o CO deshidrogenasa, como en la vía reducida de acetil coenzima A.2.1.1 Expresión de enzimas heterólogas CBBase para la fijación de CO2 en Producción de etanol de levadura en S. cerevisiae En la producción de etanol de S. cerevisiae, Guadalupe-Medina et al [2] utilizaron CO2 como aceptor de electrones para aprovechar el exceso de poder reductor, es decir, la conversión de CO2 en el metabolito intermedio Ru5P de la vía PPP mediante las enzimas RuBisCO y Prk de la vía del ciclo de la CBB, lo que resultó en un aumento del 10 % en la producción de etanol y una disminución del 90 % en la producción de glicerol como subproducto.Xia et al [3 ] encontraron un desequilibrio redox durante la fermentación anaeróbica cuando se usó xilosa como sustrato para la producción de etanol. La expresión de RrRuBisCO y SoPRK permitió la reutilización del CO2 de la descarboxilación del piruvato y redujo el rendimiento de los subproductos xilitol y glicerol. Gassler et al[4] construyeron un ciclo funcional de CBB en la levadura metilotrófica K. phaffii, que proporciona energía y poder reductor a través del metanol y produce ácido láctico y malonato utilizando CO2 como fuente de carbono.2.1.2 Vía de reducción de la glicina
La vía reductora de la glicina se considera la vía más eficiente para el crecimiento aeróbico utilizando ácido fórmico. Todas las enzimas de la vía de la proglicina están presentes en S.cerevisiae, pero no puede utilizar ácido fórmico como sustrato para el crecimiento. La sobreexpresión de las enzimas de la vía endógena dio como resultado la expresión funcional de la vía de la glicina reducida, que permite la síntesis de glicina a partir de ácido fórmico y CO2 como cosustrato para sostener el crecimiento de cepas deficientes en glicina. La vía depende de altas concentraciones de CO2 (10%). Recientemente, se identificó en K. phaffii una vía de glicina reducida naturalmente resistente al oxígeno; sin embargo, la actividad natural de esta vía no es suficiente para favorecer el crecimiento celular.
2.1.3 Rama reducida del ciclo del TCA (rTCA)
El ciclo reducido del TCA (rTCA) es una vía de fijación de CO2 que se encuentra en los procariotas. rTCA es el proceso inverso del ciclo del TCA oxidado y forma una molécula de acetil coenzima A fijando dos moléculas de CO2. Hasta ahora, el ciclo inverso completo del TCA no se ha realizado en levaduras. Se realizó rTCA parcial en Saccharomyces cerevisiae para producir ácido succínico y ácido málico. yan et al [5] sobreexpresaron los genes que codifican las tres primeras enzimas del ciclo Pyc2 y rTCA, Mdh3R, EcFumC y FrdS1, en cepas deficientes en Pdc y Fum1, lo que resultó en un rendimiento de ácido succínico de hasta 13 g/l con un rendimiento de 0,21 mol/mol. malubhoy et al [ 5] sintetizaron 35 g/L de ácido butanodioico con un rendimiento de 0,63 mol/mol de glicerol a través de la vía del ciclo rTCA, mientras que el proceso también logró la fijación neta de CO2.
2.2 Evitar descarboxilaciones innecesarias
La descarboxilación biológica ocurre principalmente en vías catabólicas como la glucólisis, la PPP y el ciclo de TCA, donde la reacción libera CO2 y a menudo se asocia con oxidación para regenerar NADH y NADPH. La descarboxilación también ocurre en las rutas de los metabolitos precursores del producto final, donde todas las reacciones de descarboxilación en la ruta reducen el rendimiento de carbono del sustrato al producto. Por ejemplo, la acetil coenzima A, un metabolito producido por la reacción de descarboxilación del piruvato, produce una pérdida del 33% de carbono en forma de CO2, lo que reduce el rendimiento teórico del producto de cualquier proceso que involucre acetil coenzima A como precursor. Como el ciclo del TCA, la biosíntesis de ácidos grasos y aminoácidos. Por lo tanto, para superar la pérdida de carbono en la síntesis de acetil coenzima A, los investigadores han evitado el paso de descarboxilación innecesaria mediante el diseño de nuevas vías de retención de carbono. Hellgren et al [6] construyeron una vía de conservación de carbono cíclica (GATHCYC) basada en la vía de la glucólisis no oxidativa (NOG), que genera tres moléculas de acetil coenzima A a partir de una molécula de fructosa 6-fosfato (F6P), y la vía no pierde carbono. El uso de esta vía resultó en un aumento del 109% en la producción de ácido 3-hidroxipropiónico.La introducción de la vía GATHCYC en una cepa productora de n-butanol dio como resultado un aumento en la producción de n-butanol a 1,75 g/l y una reducción del 35,2 % en las emisiones de CO2.

3. Producción de ácido succínico como ejemplo.
Además del equilibrio redox y la retención de carbono, la viabilidad termodinámica y el equilibrio energético son factores clave en el diseño de rutas metabólicas óptimas. La viabilidad termodinámica se refiere al cambio de energía libre de Gibbs (ΔrG’m) en condiciones estándar fisiológicamente relevantes y determina si una vía metabólica es factible o no. La energía celular también debe equilibrarse para producir más compuesto objetivo, ya que los productos que exigen energía provocan la pérdida de carbono del sustrato para satisfacer las demandas de energía, mientras que los productos oxidados provocan un exceso de energía y posiblemente una disipación de calor. El ácido succínico (SA) es un metabolito intermedio del ciclo del TCA. En esta sección, la atención se centra en diferentes estrategias para la producción de SA y se evalúan la estequiometría de ATP, el equilibrio redox, la fijación de CO2, la viabilidad termodinámica y la conservación de carbono para diferentes rutas de síntesis de SA naturales y diseñadas. Hay tres vías sintéticas para el ácido succínico: el ciclo oxidativo del TCA (oTCA), el ciclo del TCA reducido (rTCA) y la vía del glioxalato (GS). El ciclo oTCA tiene un rendimiento máximo teórico más bajo, pero la producción de ácido succínico en condiciones aeróbicas tiene la ventaja de tener bajos subproductos y atributos metabólicos termodinámicos más favorables. gS es un método alternativo para la producción de ácido succínico que evita el ácido isocítrico y la butiril coenzima A para evitar los dos pasos de descarboxilación entre el ácido isocítrico y el butanodiil coenzima A para evitar la pérdida de carbono y proporcionar NADH adicional. rTCA fija CO2 y es dos veces más eficiente que la vía oTCA. Es importante señalar que la tasa de rendimiento (YP) es un parámetro local que considera solo la estequiometría neta en la ruta y no tiene en cuenta la pérdida de carbono durante la regeneración de NAD(P)H o la generación de ATP. Sin embargo, el rendimiento teórico máximo (YE) es un parámetro global que considera el balance electrónico y por tanto también considera la regeneración de NAD(P)H. Por lo tanto, en algunos casos, YP puede ser mayor que YE. La síntesis de SA en el ciclo rTCA se lleva a cabo principalmente por bacterias del rumen en condiciones anaeróbicas. Por el contrario, para la levadura, el ciclo de rTCA es termodinámicamente desfavorable y da como resultado un suministro inadecuado de NADH celular. La siguiente figura compara el cambio en la energía libre de Gibbs de la síntesis de SA a través del ciclo oTCA o el ciclo rTCA con diferentes fuentes de carbono.Esto incluye glucosa, glicerol, xilosa a través del ciclo parcial de CBB, asimilación de ácido fórmico o metanol a través de la vía de la glicina reducida y asimilación de metanol a través de la vía del fosfato de xiloglucano. Figura 2. Producción de ácido succínico utilizando la rama oxidativa o reductora del ciclo del TCA
La capacidad de la levadura para tolerar un pH más bajo y así reducir el costo de producción de SA durante el procesamiento posterior ha llevado a que la producción de SA mediante levadura atraiga una atención generalizada, especialmente el ciclo rTCA que es capaz de fijar CO2. Aunque la síntesis de SA a partir de glucosa a través de la glucólisis y la vía del ciclo de rTCA puede fijar 1 mol de CO2/mol de SA, la vía no está equilibrada en redox y requiere 1 mol de NADH adicional por cada 1 mol de SA producido. Una alternativa atractiva es utilizar glicerol como fuente de carbono, que puede fijar 1 mol de CO2/mol de SA a través de la vía de rTCA, lo que permite una producción de SA equilibrada por reducción oxidativa. La reducción total γ = 3,5 para la combinación de glicerol + CO2 es la misma que la del SA. Malubhoy et al [5] lograron un rendimiento de 0,6 g/g de glicerol fijando CO2, que fue el 47,1% del máximo teórico.
Otra forma de lograr el equilibrio redox es utilizar glucosa y CO2 como cosustratos. Si se utilizan simultáneamente la glucólisis, el GATHCYC y los ciclos parciales de TCA, se puede alcanzar teóricamente el equilibrio redox, con 1 mol de SA fijando 0,5 moles de CO2. sin embargo, 1 mol de SA requiere el consumo de 0,33 moles de ATP a costa de ATP regenerado, p.e. por la respiración de parte de la glucosa. por lo tanto, este escenario debe realizarse al menos en condiciones ligeramente aeróbicas, lo que añade otro factor de costo del proceso.
Fig. 3 Producción neutra en redox de ácido butanodioico a través de una combinación de glucólisis, GATHCYC, ciclo parcial de TCA y la vía del glioxilato Tabla 1 Comparación de vías naturales y modificadas para la síntesis de SA en levaduras

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Preguntas frecuentes para compradores y formuladores

¿Por qué una enzima de alta actividad no es automáticamente la mejor opción comercial?
Porque la mejor enzima es la que funciona de manera confiable en las condiciones reales del proceso y brinda el resultado final deseado sin crear nuevos problemas.

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Por lo general, es más seguro combinar la revisión de especificaciones con una prueba piloto o de aplicación porque los sustratos reales y las ventanas de proceso pueden cambiar mucho el resultado.