La eficiencia del carbono es uno de los principales factores que definen la viabilidad de un proceso de vía y es el principal determinante de la tasa de producto por unidad de sustrato. Dos factores determinan la eficiencia del carbono: el equilibrio de electrones del sustrato al producto, que puede calcularse a partir del grado de reducción del sustrato y el producto, y el hecho de que las vías metabólicas existentes están diseñadas principalmente para tasas de reacción más altas en lugar de altos rendimientos de carbono. El primer factor está estrechamente relacionado con la composición química del sustrato y el producto. El segundo factor puede superarse rediseñando la vía metabólica, lo que permite retener el carbono del sustrato o, en algunos casos, asimilarlo durante la formación del producto.
1. Equilibrio redox en el metabolismo de la levadura La eficiencia de las vías metabólicas necesarias para una producción biológica eficiente de sustancias químicas depende de diversos factores, como el equilibrio redox, el equilibrio energético, la viabilidad termodinámica, el equilibrio estequiométrico, el acoplamiento de flujos, la inhibición por retroalimentación, la toxicidad del producto, la cinética, etc. El metabolismo celular mantiene el crecimiento celular y el equilibrio redox mediante la transferencia de electrones de los sustratos a diferentes metabolitos. Por lo tanto, la ruta biosintética óptima para la producción de un metabolito deseado debe ser redox-neutral y el rendimiento de la ruta (YP) debe estar en, o muy cerca de, el rendimiento teórico máximo (YE) de la combinación sustrato-producto objetivo. El YP depende de la vía implicada y se determina en función de su estequiometría, mientras que el YE es la cantidad máxima de producto que puede formarse a partir del sustrato y puede calcularse a partir de la relación sustrato-producto γS/γP, donde γS y γP son el grado de reducción del sustrato y del producto, respectivamente. El grado de reducción puede definirse como el número de equivalentes de electrones disponibles por átomo de carbono del compuesto. Por lo tanto, la levadura necesita tener en cuenta el equilibrio de electrones para la conversión de un sustrato en un producto, lo que puede requerir descarboxilación, que conduce a la pérdida de carbono, o carboxilación, que proporciona una absorción adicional de carbono. La siguiente figura muestra la vía metabólica central de la levadura. Figura 1. Ruta metabólica central del carbono de la levadura, destacando la relación entre los pasos de carboxilación/descarboxilación y los cambios en el grado de reducción del sustrato y del producto. El grado de reducción de los sustratos correspondientes, metabolitos intermedios y productos se indica por el cambio de color de rojo (γ=0) a amarillo (γ=4) a azul (γ=6)
Según el grado de reducción del sustrato y del producto objetivo, se puede dividir en tres casos: cuando el sustrato y el producto objetivo tienen el mismo grado de reducción, existe una situación ideal en la que el sustrato se convierte completamente en producto. Es decir, el rendimiento real del producto puede acercarse al rendimiento teórico máximo (YE), pero el proceso metabólico producirá subproductos para la formación de biomasa y el mantenimiento del crecimiento celular, lo que reducirá el rendimiento del producto. Un ejemplo es el ácido láctico (γ = 4,0), que tiene el mismo grado de reducción que la glucosa (γ = 4,0). Por lo tanto, el proceso de producción de lactato es una vía redox neutra con una estequiometría equilibrada, al tiempo que permite la generación de ATP, lo que da como resultado una tasa cercana al rendimiento teórico máximo. En general, para otros productos de sustrato, es raro encontrar vías que no generen un poder reductor excesivo.
Cuando el producto está más reducido que el sustrato, las reacciones de oxidación necesarias para formar el producto generan equivalentes oxidativos adicionales (NAD+, NADP+, FADH+). Para reducir estos equivalentes oxidativos, la célula necesita oxidar el carbono a CO2 y/u otros subproductos (por ejemplo, en la vía de las pentosas fosfato (PPP), el ciclo del TCA o el ciclo del fosfato de xilulosa (XuMP)) para mantener la homeostasis redox. Este proceso puede afectar a la eficiencia general de la conversión de sustrato en productos objetivo. Algunos ejemplos son los ácidos grasos, el etanol y el glicerol.
El uso de glucosa como sustrato para generar ácidos grasos, como el ácido palmítico (γ = 5,75), reduce el rendimiento de los ácidos grasos debido a los elevados requisitos de NADPH y a la liberación de CO2 durante la extensión de la cadena de carbono, lo que conduce a la pérdida de sustrato. Yu et al [1] lograron aumentar los rendimientos de ácidos grasos en Saccharomyces cerevisiae hasta un 40 % mediante la construcción de una vía metabólica anabólica reductora caracterizada por un ciclo de descarboxilación repetitivo para suministrar a la célula NADH, NADPH y ATP adicionales.
La producción de etanol a partir de glucosa también oxida algunos sustratos a CO2 y glicerol debido a la necesidad de suministrar NADH. Sin embargo, la vía natural de la levadura para fermentar etanol conserva el grado de reducción de la glucosa (γ = 4,0), con una reducción media global de γ = 4,0 cuando el CO2 y el etanol son los productos finales. Así pues, la vía metabólica es muy eficiente desde el punto de vista del rendimiento, ya que solo convierte entre el 4 y el 5 % de la fuente de carbono en glicerol. De manera similar, cuando la levadura de cerveza produjo 1,2-propanodiol (1,2-PDO) (γ=5,33) utilizando glicerol (γ=4,66) como única fuente de carbono, la modificación de la ingeniería metabólica proporcionó NADH adicional para facilitar la síntesis de 1,2-PDO, logrando los mayores rendimientos hasta la fecha en levadura de >4 g/L de 1,2-PDO.
Cuando el producto se reduce por debajo del sustrato, se generan tanto equivalentes reductores como producto durante la producción del producto. Un mecanismo común para reoxidar el exceso de equivalentes reductores es la oxidación por la cadena respiratoria, que genera un exceso de ATP y/o libera calor. Como resultado, el rendimiento del producto está por debajo del máximo teórico alcanzable con los electrones disponibles. Alternativamente, el exceso de equivalentes reductores puede consumirse reduciendo parte de la fuente de carbono a subproductos reductores. Esta combinación sustrato-producto tiene el potencial de fijar carbono para aumentar el rendimiento del metabolito objetivo. Al igual que en la producción de ácido cítrico (γ = 3,0) a partir de glucosa, el exceso de energía debido a la formación de NADH significa que la célula puede simplemente ganar energía produciendo el compuesto objetivo a costa de perder rendimiento. La escasa eficiencia de la vía bioquímica natural para la síntesis de ácido cítrico representa, por tanto, una oportunidad para alcanzar una tasa de ganancia cercana a la máxima teórica que se puede lograr mediante la fijación de carbono.
Por lo tanto, los sustratos para su uso en el producto deseado pueden seleccionarse en función de la maximización del rendimiento de γS y γP. El sustrato preferido de la levadura, la glucosa, puede utilizarse para sintetizar productos con el mismo γ que la glucosa, como el etanol (más CO2) o el ácido láctico. Aunque la glucosa es el sustrato preferido, compite directamente con la producción de alimentos o piensos. Por lo tanto, varias fuentes de carbono más baratas, como el glicerol, el metanol y el CO2, se consideran sustratos prometedores.
El metanol (γ = 6,0) es una materia prima C1 con un alto grado de reducción. Una de las principales ventajas de utilizar metanol como fuente de carbono es su poder reductor, que en microorganismos como la levadura metilotrófica forma NADH y genera ATP. Sin embargo, dado que la primera reacción de la vía es la oxidación del metanol a formaldehído utilizando oxígeno como aceptor de electrones, la levadura pierde un NADH por cada porción de metanol absorbida. Estudios recientes han demostrado que Komagataella phaffii es capaz de utilizar el metanol de manera más eficiente mediante la sobreexpresión de la metanol deshidrogenasa endógena (Adh2) en una cepa deficiente en alcohol oxidasa (Mut-), lo que da lugar a la producción de NADH y ATP adicionales por porción de metanol. Esto permite a la cepa Mut-Adh2 aumentar la intensidad de producción de proteínas heterólogas en condiciones de bajo consumo de oxígeno y emisión de calor.
Otra fuente de carbono prometedora es el CO2, que es un compuesto altamente oxidado (γ=0) que puede ser reducido por autótrofos para producir compuestos orgánicos para la biosíntesis. Por lo tanto, una forma de introducir CO2 en el metabolismo de la levadura es la conversión de cosustrato, que convierte el CO2 junto con otra fuente de carbono en un producto con un grado de reducción menor que el cosustrato. En la biosíntesis de ácidos orgánicos, que tienen un γ menor que la glucosa, como los ácidos cítrico, maleico y succínico, esta estrategia permite la incorporación de CO2 en procesos de fermentación industrial para aumentar el rendimiento de carbono.
2. ¿Cómo equilibrar el grado de reducción del producto? La evolución de los procesos metabólicos en los microorganismos suele basarse en el rápido crecimiento de las células más que en la producción de productos específicos. Por lo tanto, la célula favorece el metabolismo rápido sobre el alto rendimiento de carbono. Por lo tanto, la capacidad de las células para mejorar la retención de carbono durante el metabolismo es uno de los mayores retos de la ingeniería metabólica, lo que impide que las fábricas microbianas logren una producción química de alto rendimiento. Este artículo analiza la ingeniería metabólica de la levadura con el objetivo de maximizar la retención de carbono, incluida la fijación de CO2, así como evitar los pasos de descarboxilación no esenciales en la célula. 2.1 Integración del carbono inorgánico en el metabolismo celular utilizando CO2 como sustrato Existen diferentes vías: una molécula de CO2 forma compuestos orgánicos por carboxilación; el CO2 se convierte por reducción en ácido fórmico o CO, que puede asimilarse en la biomasa. Las reacciones de carboxilación son catalizadas por carboxilasas, como la RuBisCO en el ciclo CBB de la vía autotrófica de fijación de CO2 o las enzimas de la vía Pck y Pyc, que participan en el suministro de precursores metabólicos centrales. El principio de reducción del carbono es que el CO2 se reduce a ácido fórmico o CO por la formiato deshidrogenasa o la CO deshidrogenasa, como en la vía de la acetil coenzima A reducida. 2.1.1 Expresión de enzimas heterólogas de la CBB para la fijación de CO2 en la producción de etanol de levadura en S. cerevisiae En la producción de etanol de S. cerevisiae, Guadalupe-Medina et al [2] utilizaron el CO2 como aceptor de electrones para aprovechar el exceso de poder reductor, es decir, la conversión de CO2 en el metabolito intermedio de la vía PPP Ru5P por las enzimas de la vía del ciclo CBB RuBisCO y Prk, lo que dio lugar a un aumento del 10 % en la producción de etanol y una disminución del 90 % en la es decir, la conversión de CO2 en el metabolito intermedio de la vía PPP Ru5P por las enzimas de la vía del ciclo CBB RuBisCO y Prk, lo que da como resultado un aumento del 10 % en la producción de etanol y una disminución del 90 % en la producción de glicerol como subproducto. Xia et al [3] encontraron un desequilibrio redox durante la fermentación anaeróbica cuando se utilizaba xilosa como sustrato para la producción de etanol. La expresión de RrRuBisCO y SoPRK permitió la reutilización del CO2 de la descarboxilación del piruvato y redujo el rendimiento de los subproductos xilitol y glicerol. Gassler et al[4] construyeron un ciclo CBB funcional en la levadura metilotrófica K. phaffii, que proporciona energía y poder reductor a través del metanol y produce ácido láctico y malonato utilizando CO2 como fuente de carbono. 2.1.2 Vía reductora de la glicina
La vía reductora de la glicina se considera la vía más eficiente para el crecimiento aeróbico utilizando ácido fórmico. Todas las enzimas de la vía pro-glicina están presentes en S. cerevisiae, pero no puede utilizar ácido fórmico como sustrato para el crecimiento. La sobreexpresión de las enzimas de la vía endógena dio lugar a la expresión funcional de la vía de la glicina reducida, que permite la síntesis de glicina a partir de ácido fórmico y CO2 como cosustrato para mantener el crecimiento de cepas deficientes en glicina. La vía depende de altas concentraciones de CO2 (10 %). Recientemente, se ha identificado en K. phaffii una vía de glicina reducida naturalmente resistente al oxígeno, aunque la actividad natural de esta vía no es suficiente para sustentar el crecimiento celular.
2.1.3 Rama reducida del ciclo del ácido tricarboxílico (rTCA)
El ciclo reducido del ácido tricarboxílico (rTCA) es una vía de fijación de CO2 que se encuentra en los procariotas. El rTCA es el proceso inverso del ciclo oxidado del ácido tricarboxílico y forma una molécula de acetil coenzima A fijando dos moléculas de CO2. Hasta ahora, no se ha realizado el ciclo completo inverso del ácido tricarboxílico en la levadura. Se realizó un rTCA parcial en Saccharomyces cerevisiae para producir ácido succínico y ácido málico. Yan et al [5] sobreexpresaron los genes que codifican las tres primeras enzimas del ciclo Pyc2 y rTCA, Mdh3R, EcFumC y FrdS1, en cepas deficientes en Pdc y Fum1, lo que dio como resultado un rendimiento de ácido succínico de hasta 13 g/l con un rendimiento de 0,21 mol/mol. Malubhoy et al [5] sintetizaron 35 g/l de ácido butanodioico con un rendimiento de 0,63 mol/mol de glicerol a través de la vía del ciclo del TCA, mientras que el proceso también logró la fijación neta de CO2.
2.2 Evitar la descarboxilación innecesaria
La descarboxilación biológica se produce principalmente en vías catabólicas como la glucólisis, la PPP y el ciclo del TCA, donde la reacción libera CO2 y a menudo se asocia con la oxidación para regenerar NADH y NADPH. La descarboxilación también se produce en las vías de los metabolitos precursores de los productos finales, donde las reacciones de descarboxilación en la vía reducen el rendimiento de carbono del sustrato al producto. Por ejemplo, la acetil coenzima A, un metabolito producido por la reacción de descarboxilación del piruvato, da lugar a una pérdida del 33 % de carbono en forma de CO2, lo que reduce el rendimiento teórico del producto de cualquier proceso que implique la acetil coenzima A como precursor. Como el ciclo del ácido tricarboxílico, la biosíntesis de ácidos grasos y aminoácidos. Por lo tanto, para superar la pérdida de carbono en la síntesis de acetil coenzima A, los investigadores han evitado el paso innecesario de descarboxilación diseñando nuevas vías de retención de carbono. Hellgren et al [6] construyeron una vía cíclica de conservación de carbono (GATHCYC) basada en la vía de glucólisis no oxidativa (NOG), que genera tres moléculas de acetil coenzima A a partir de una molécula de fructosa 6-fosfato (F6P), y la vía no pierde carbono. El uso de esta vía dio lugar a un aumento del 109 % en la producción de ácido 3-hidroxipropiónico. La introducción de la vía GATHCYC en una cepa productora de n-butanol dio lugar a un aumento de la producción de n-butanol a 1,75 g/l y a una reducción del 35,2 % de las emisiones de CO2.
3. La producción de ácido succínico como ejemplo
Además del equilibrio redox y la retención de carbono, la viabilidad termodinámica y el balance energético son factores clave en el diseño de vías metabólicas óptimas. La viabilidad termodinámica se refiere al cambio de energía libre de Gibbs (ΔrG’m) en condiciones estándar fisiológicamente relevantes y determina si una vía metabólica es viable o no. La energía celular también debe equilibrarse para producir más del compuesto objetivo, ya que los productos que demandan energía conducen a la pérdida de carbono del sustrato para satisfacer las demandas de energía, mientras que los productos oxidados conducen a un exceso de energía y posiblemente a la disipación de calor. El ácido succínico (AS) es un metabolito intermedio del ciclo del TCA. En esta sección, nos centramos en diferentes estrategias para la producción de AS y evaluamos la estequiometría del ATP, el equilibrio redox, la fijación de CO2, la viabilidad termodinámica y la conservación del carbono para diferentes vías de síntesis de AS naturales y artificiales. Hay tres vías sintéticas para el ácido succínico: el ciclo oxidativo del TCA (oTCA), el ciclo reducido del TCA (rTCA) y la vía del glioxalato (GS). El ciclo oTCA tiene un rendimiento máximo teórico menor, pero la producción de ácido succínico en condiciones aeróbicas tiene la ventaja de producir pocos subproductos y de tener atributos metabólicos termodinámicos más favorables. El gS es un método alternativo para la producción de ácido succínico que evita el ácido isocítrico y la butiril coenzima A para evitar los dos pasos de descarboxilación entre el ácido isocítrico y la butanodiol coenzima A para prevenir la pérdida de carbono y proporcionar NADH adicional. El rTCA fija el CO2 y es dos veces más eficiente que la vía del oTCA. Es importante señalar que la tasa de rendimiento (YP) es un parámetro local que considera solo la estequiometría neta en la vía y no tiene en cuenta la pérdida de carbono durante la regeneración de NAD(P)H o la generación de ATP. Sin embargo, el rendimiento teórico máximo (YE) es un parámetro global que considera el equilibrio de electrones y, por lo tanto, también considera la regeneración de NAD(P)H. Por lo tanto, en algunos casos, YP puede ser mayor que YE. La síntesis del ciclo rTCA de SA se lleva a cabo principalmente por bacterias del rumen en condiciones anaeróbicas. En cambio, para la levadura, el ciclo rTCA es termodinámicamente desfavorable y da lugar a un suministro inadecuado de NADH celular. La siguiente figura compara el cambio en la energía libre de Gibbs de la síntesis de SA a través del ciclo oTCA o del ciclo rTCA con diferentes fuentes de carbono. Esto incluye glucosa, glicerol, xilosa a través del ciclo parcial de CBB, asimilación de ácido fórmico o metanol a través de la vía de la glicina reducida y asimilación de metanol a través de la vía del fosfato de xiloglucano. Figura 2. Producción de ácido succínico utilizando la rama oxidativa o reductora del ciclo del TCA
La capacidad de la levadura para tolerar un pH más bajo y, por lo tanto, reducir el coste de la producción de ácido succínico durante el procesamiento posterior ha llevado a que la producción de ácido succínico por levadura atraiga una gran atención, especialmente el ciclo del ácido tricarboxílico reducido, que es capaz de fijar el CO2. Aunque la síntesis de ácido succínico a partir de glucosa mediante glucólisis y la vía del ciclo rTCA puede fijar 1 mol de CO2/mol de ácido succínico, la vía no está equilibrada redoxmente y requiere 1 mol adicional de NADH por cada 1 mol de ácido succínico producido. Una alternativa atractiva es utilizar glicerol como fuente de carbono, que puede fijar 1 mol de CO2/mol de ácido succínico a través de la vía rTCA, lo que permite una producción de ácido succínico equilibrada oxidativamente. La reducción total γ = 3,5 para la combinación de glicerol + CO2 es la misma que la de SA. Malubhoy et al [5] lograron un rendimiento de 0,6 g/g de glicerol mediante la fijación de CO2, que fue el 47,1 % del máximo teórico.
Otra forma de lograr el equilibrio redox es utilizar glucosa y CO2 como cosustratos. Si se utilizan simultáneamente la glucólisis, el ciclo de Krebs y el ciclo de Krebs parcial, se puede lograr teóricamente el equilibrio redox, con 1 mol de ácido succínico fijando 0,5 mol de CO2. Sin embargo, 1 mol de ácido succínico requiere el consumo de 0,33 mol de ATP a costa del ATP regenerado, por ejemplo, mediante la respiración de parte de la glucosa. Por lo tanto, este escenario debe llevarse a cabo en condiciones al menos ligeramente aeróbicas, lo que añade otro factor de coste al proceso.
Fig. 3 Producción redox neutra de ácido butanodioico mediante una combinación de glucólisis, GATHCYC, ciclo parcial del TCA y la vía del glioxilato. Tabla 1 Comparación de las vías naturales y artificiales para la síntesis de ácido butanodioico en levadura.